局灶性脑缺血后嗜酸性神经元死亡的通路

王宗丽　沈艳玲　张元榛　付金涛　孙立元

[摘要]目的 局灶性脑缺血后产生各种类型的嗜酸性神经元（ENs）。为了探讨大鼠局灶性脑缺血后大脑皮质中心区和周边区ENs的形态学特征，及细胞死亡相关因子在ENs中的表达。方法 夹闭蒙古沙鼠单侧颈总动脉制作前脑缺血模型，于3h至2周在显微镜下行ENs形态学和免疫组织化学分析。结果 光镜：细胞核轻度异常的ENs缺血3h后出现于中心区，12h后出现于周边区，calcium、μ-calpain、GRP78和ubiquitin在该型ENs中呈阳性。中心区，核固缩和胞体不规则萎缩的ENs缺血12h后达峰值，calcium、μ-calpain表达进一步增高；核固缩和胞体极度萎缩的ENs 4d后达峰值，calcium、TUNEL染色呈阳性。周边区，ENs的胞体轻度萎缩，于1周后相继呈现核固缩、核碎裂、核溶解，同时calcium、TUNEL染色呈阳性。活化型caspase 3在中心区与周边区的各型ENs中均呈阴性。电镜：中心区，ENs的染色质凝集成不规则团块状，细胞质中出现大量空胞，核膜及胞膜均破裂。周边区，ENs的染色质凝集、碎裂呈不规则团块，最终均质化，核膜边界模糊，胞膜仍保持完整。结论局灶性脑缺血后ENs呈现了两种死亡途径：缺血中心区核固缩伴胞体极度萎缩；周边区核溶解伴胞体轻度萎缩。ENs不同形态学的改变与不同细胞死亡相关因子的活化相对应。

[关键词]calpam；嗜酸性神经元；前脑缺血；梗死；蒙古沙鼠

[中图分类号]R364.1 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2016）11-25-06

局灶性脑缺血导致两种类型的形态学损伤：选择性神经元死亡和梗死。临床和实验数据表明选择性神经元死亡位于梗死灶的周边部。嗜酸性神经元（eosinophilic neurons，ENs）是神经细胞缺血性损伤的一种形式，呈均匀一致的嗜酸性胞质染色及细胞核固缩、碎裂、溶解，常位于梗死的周边区。我们的研究显示：皮质高密度ENs区域进展为梗死，而低密度ENs区域进展为选择性神经元死亡。不仅ENs的细胞核发生固缩、碎裂、溶解，细胞体也从萎缩进展为肿胀。因此，脑缺血后出现各种形态的ENs，可能反映了不同的缺血程度、时间经过或细胞死亡机制。

谷氨酸的异常大量释放及其诱发的钙内流是神经元缺血性损伤的上游通路，细胞坏死是缺血后细胞死亡的主要机制，而由caspase家族调控的细胞凋亡也被报道出现在脑缺血模型中。此外，细胞内蛋白质异常降解、依赖ATP的泛素一蛋白酶体功能障碍也可能参与了缺血后神经元死亡。

我们使用梗死灶呈缓慢进展的沙鼠局灶性脑缺血动物模型，探讨局灶性脑缺血后大脑皮质ENs的形态学特征及细胞死亡相关因子在中心区与周边区ENs中的表达。

1材料与方法

1.1一般材料

异氟醚（安耐吉化学）；二乙醚（上海麦克林生化科技有限公司）；多聚甲醛（北京索莱宝生物科技有限公司）；PBS缓冲液（北京雷根生物技术有限公司）；山羊血清（北京索莱宝生物科技有限公司）；茜素红（AMR，Solon，Ohio，USA；1%）；细胞凋亡原位检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；锇酸磷酸盐缓冲液（广州竞赢化工科技有限公司）；柠檬酸铅（安耐吉化学）；乙酸双氧铀（成都麦卡希化工有限公司）；坏死相关蛋白酶抗体—mouseanti-μ-calpain（Chemicon；1：500稀释）；细胞凋亡因子抗体—rabbit anti-actived caspase 3-p17（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA；1：500）；内质网应激蛋白抗体—mouse anti-GRP 78（Santa Cruz Bioteehnology；1：800）；蛋白质降解标志抗体—蛋白质降解标志物抗体—rabbit anti-ubiquitin（Dako Cytomation，Glostrup，DK；1：1000）。

1.2实验动物

雄性蒙古沙鼠87只，16～20周龄，体重（66±6）g，购自三共制药（Sankyo，东京）实验动物中心。实验按照全国卫生研究所制定的关爱和使用动物用于研究的指导方针和学校动物实验委员会的管理条例进行。

1.3实验方法

1.3.1动物模型的制备 2%异氟醚麻醉，切开左颈皮肤，分离左颈动脉用小动脉夹夹闭10min诱发脑缺血。在颈动脉夹闭后进行卒中指数（strokeindex，SI）评分（总分25分），见表1；SI≥10可进展为脑梗死。为减少缺血性损伤的个体差异，我们选择卒中指数14～17分（n=28）的动物作为“缺血动物”用于后续实验，5h后以相同的处理方式再次使动物缺血10min。两次缺血处理比单次缺血处理动物死亡率低。假手术组（n=4）以相同手术方式处理，但左侧颈动脉不夹闭。

1.3.2取材 在缺血后3、6、12、24h，4d，1、2周，动物（每组4只）用二乙醚深度麻醉，4%缓冲多聚甲醛心内灌注固定。脑组织切成3个序列冠状切面：A面（前囟前0.5mm）、B面（前囟后1.5mm）、C面（前囟后3mm）。常规石蜡包埋切片（4μm），HE染色光镜下观察ENs的形态和分布。

1.3.3 ENs的定义 ENs是脑缺血后出现的胞质嗜酸性及细胞核固缩、碎裂、溶解的神经元。缺血急性期部分ENs的细胞核异常伴胞浆嗜酸性，细胞体由肿胀至萎缩、由圆形至不规则。ENs根据形态学特征分为6种类型见表2：核轻度异常和胞体肿胀（图1C、G、H，箭头）；核固缩和胞体不规则萎缩（图1D，箭头）；核固缩和胞体极度萎缩（图1E，箭头）；核固缩和胞体轻度萎缩（图1H、I，楔形箭头）；核碎裂和胞体轻度萎缩（图1I，空白箭头）；核溶解和胞体轻度萎缩（图1T、J，箭头）。

1.3.4形态定量分析 为了探究ENs在皮层的纵向分布，在前囟前0.5ram，旁2.5、5.7mm的冠状面上定义ROIs区（regions nf interest，ROIs）一与脑皮质表面垂直，宽0.5ram的条形区域（图1B）。与我们的前期研究一致，缺血灶中心的正常组织进展为梗死（图1F），而周边的组织进展为选择性神经元死亡（图1J），且缺血后2周持续存在。光镜（×200）下计数ROIs区的ENs。

1.3.5免疫组织化学染色 HE染色的切片脱色后进行免疫组织化学染色，分析各型ENs中的细胞死亡相关因子。脱蜡进行HE染色的切片，在显微照片（×400）中记录ROIs区ENs的形态学特征。然后用1%盐酸和80%酒精处理脱去HE染色，进行免疫组织化学染色。

1.3.5.1钙染色 脱去HE染色的切片浸入茜素红处理10min，使蓄积的钙显色。

1.3.5.2 TUNEL染色 用于检测DNA断裂。脱去HE染色的切片用细胞凋亡原位检测试剂盒进行TUNEL染色。切片在蛋白消化酶液中孵育5min，37℃，PBS冲洗，加TdT反应液孵育10min，37℃，PBS冲洗。再滴加3%H₂O₂室温5min，灭活内源性过氧化物酶。然后加过氧化物酶结合的抗体液，10min，37℃，PBS冲洗，再滴加DAB液室温5min。

未进行HE染色与脱去HE染色的切片作对照以控制HE染色及脱色对免疫组织化学染色的影响。部分切片不加TdT酶进行温箱孵育，作为阴性对照。

1.3.6免疫染色细胞阳性率 通过比较相同ROIs区的HE染色与HE染色脱色后进行免疫组织化学染色的显微照片得到各型ENs免疫染色阳性的百分数，将其分为四种级别：76%～100%为（+++）、51%～75%为（++）、26%～50%为（+）、≤25%为（-）。

1.3.7透射电镜切片制备 假手术组和脑缺血组动物（每组4只）用4%多聚甲醛加5%戊二醛的0.1mol/L的PBS灌注取脑，脑组织浸入灌注液中，作冠状切，从ROIs区获取脑组织样本。用1%锇酸磷酸盐缓冲液固定3h，梯度丙酮脱水，环氧树脂包埋。制成超薄切片（100nm），柠檬酸铅和乙酸双氧铀染色，透射电子显微镜观察ENs的超微结构特征。

2结果

2.1 ENs的定量分析

假手术组脑组织未见ENs。缺血中心的ROI区（图1K），核轻度异常和胞体肿胀的ENs缺血3h后出现，6h达峰值，12、24h后减少。核固缩和胞体不规则萎缩的ENs缺血6h后出现，12h达峰值，4d后减少。核固缩和胞体极度萎缩的ENs缺血24h后出现，4d达峰值，1周后减少。该型ENs区域2周后进展为梗死（图1A、F）。缺血周边的ROI区（图1L），核轻度异常和胞体肿胀的ENs缺血12、24h后出现。之后，核固缩、核碎裂、核溶解的ENs缺血24h、4d后相继出现。核固缩、核碎裂的ENs缺血1、2周后减少，而核溶解的ENs进一步增多。

2.2细胞死亡相关因子的表达

首先行HE染色，拍照记录各型ENs，然后脱去HE染色，检测细胞死亡相关因子在各型ENs的表达（表3，图2）。

缺血中心区，核轻度异常和胞体肿胀的ENs表达calcium（64.5±9.4）%、μ-calpain（46.5±8.3）%、GRP 78（78.8±14.4）%、ubiquitin（75.7±11.6）%等细胞死亡相关因子。胞体不规则萎缩的ENs中calcium（91.4±7.2）%、μ-calpain（88.9±10.7）%的表达增高。胞体极度萎缩的ENs中calcium、TUNEL染色的阳性率分别为（73.8±10.2）%、（85.4±7.5）%，而胞体不规则萎缩与胞体极度萎缩的ENs中活化型caspase 3均呈阴性。

周边区，核轻度异常和胞体肿胀的ENs中也表达calcium（60.5±10.7%、GRP78（75.8±12.6%、ubiquitin（70.7±12.7）%等细胞死亡相关因子，但μ-calpain（8.1±4.4）%呈阴性。核固缩、核碎裂的ENs中钙染色的阳性率分别为（64.6±13.1）%、（47.9±13.4）%；TUNEL染色在两种ENs中的阳性率分别为（69.4±8.5）%、（71.6±9.4）%；而caspase 3（2.6±1.8）%、（4.5±3.5）%和μ-calpain（4.5±3.5）%、（3.6±3.3）%在两种ENs中始终呈阴性。

2.3超微结构特征

假手术组神经元的细胞核、线粒体、糙面内质网、高尔基复合体及多聚核糖体的结构清晰，形态均正常（图3A）。

缺血中心区，核固缩和胞体极度萎缩的ENs缺血24h后出现，4d达峰值。缺血1d后可见大量不规则团块状的染色质凝集，胞质出现大量难以识别的空胞。缺血4d后核膜（图3B，箭头）及胞膜（图3B，楔形箭头）均破裂。

周边区，核碎裂和胞体轻度萎缩的ENs中可见碎裂、不规则的染色质团（图3C，箭头），胞质密度增高，空胞结构不清，核膜边界模糊，而细胞质保持完整。核溶解和胞体轻度萎缩的ENs染色质均质化，胞质完整，内有大量空胞（图3D，箭头），部分细胞器残存（图3D，楔形箭头）。

3讨论

研究表明，缺血中心区及周边区神经元的死亡机制呈多样性，这与缺血后神经元不同的形态学改变相关。我们发现ENs有两种死亡途径：缺血中心区核固缩伴胞体极度萎缩；周边区核溶解伴胞体嗜酸性、轻度萎缩。还发现ENs不同的形态学改变与不同细胞死亡相关因子的活化相对应。缺血后神经元不可逆性损伤在光镜下的特征为细胞核固缩、碎裂、溶解伴胞浆红染或失去对苏木素的亲和力。细胞坏死的两种形态学改变为：核膜及胞膜破裂；核溶解而胞膜完整。缺血急性期ENs胞体萎缩、嗜酸性伴核固缩，晚期细胞核失去对苏木素的亲和力伴胞浆轻度红染（鬼影细胞）。这些发现与我们观察到的ENs核固缩伴胞体萎缩仅见于缺血中心区相一致。核轻度异常和胞体肿胀的ENs是中心区或周边区最早出现的ENs。“肿胀细胞”具有类似的形态学改变：胞体肿胀、核正常而染色质呈不规则团块状，过去的研究称之为“尼氏体溶解”。这些改变多见于急性期，如大鼠脑缺氧缺血后3～4h。

各型ENs出现的时序性显示细胞从一种形态进展到另一种形态。中心区核固缩和胞体不规则萎缩的ENs迟于核轻度异常和胞体肿胀的ENs出现，且calcium、μ-calpain表达进一步增高，之后出现的核固缩和胞体极度萎缩的ENs呈TUNEL染色阳性，这可能是损伤组织进展为梗死前的最终变化。周边区ENs在GRP78、ubiquitin染色呈阳性，细胞内蛋白质异常降解、依赖ATP的泛素-蛋白酶体功能障碍可能参与了缺血后周边区ENs死亡。

在周边区，许多研究依据活化型caspase 3、TUNEL染色阳性推测缺血神经元死亡的主要机制为细胞凋亡。我们的结果显示大部分ENs在活化型caspase 3染色呈阴性（表3，图2E、E），而我们使用的抗体检测caspase 3的p17亚基，可区分细胞凋亡与非细胞凋亡。我们的结果表明caspase 3依赖的细胞凋亡途径可能不是周边区ENs死亡的主要机制。近期研究表明活化型caspase 3在成熟缺血脑组织中呈阴性，在未成熟大脑中呈阳性。此外，在缺血中心区与周边区多型ENs呈现TUNEL阳性，由于细胞坏死的最后阶段发生DNA断裂，TUNEL染色也可能阳性，所以呈TUNEL染色阳性的ENs不能证明一定发生细胞凋亡。

神经元坏死有两种超微形态学特征：细胞核肿胀、溶解，细胞膜破裂内容物流出；细胞器肿胀，细胞萎缩。我们的研究显示，在缺血中心区，神经元变性的最后阶段是核固缩和胞体极度萎缩的ENs，兼具两种坏死的特点：染色质凝集、碎裂伴细胞膜破裂。在周边区，核固缩、核碎裂伴胞体轻度萎缩的ENs在HE染色凋亡样改变，且TUNEL染色也呈阳性，电镜下进一步可见凝集、不规则的染色质团。但定量分析表明核溶解和胞体轻度萎缩的ENs是周边区神经元死亡的最后阶段。有早期研究提出，细胞死亡可能存在一个从凋亡（早期损伤）到坏死（晚期损伤）的过程。本研究结果提示，缺血周边区ENs的死亡途径是从凋亡到坏死。

总之，本研究表明，局灶性脑缺血后ENs有两种死亡途径：缺血中心区核固缩伴胞体极度萎缩；周边区核溶解伴胞体轻度萎缩。ENs不同形态学的改变与不同细胞死亡相关因子的活化相对应。