镇江香醋醋醅中优势高产酸醋酸菌菌株的筛选

张志燕,钱静亚,马　真,张正沛,郁晓晨,马海乐,*

(1.江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013;2.江苏大学生命科学研究院,江苏镇江 212013)



镇江香醋醋醅中优势高产酸醋酸菌菌株的筛选

张志燕1,2,钱静亚1,马真1,张正沛1,郁晓晨1,马海乐1,*

(1.江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013;2.江苏大学生命科学研究院,江苏镇江 212013)

镇江香醋是中国传统发酵香醋之一,具有较高的营养价值。本实验对镇江香醋醋醅中高产酸的优势醋酸菌进行了筛选和分离鉴定。最终分离得到15株产酸菌,通过16S rDNA序列分析,鉴定出8株醋酸菌。8株醋酸菌产酸分析结果表明,醋酸菌D-3-4的产酸量达到60 g/L,为高产酸菌株。对8株醋酸菌进行耐酒精、耐温度、耐乙酸性能测试后发现:在酒精浓度不超过9%时,醋酸菌D-3-4的产酸量最高;当酒精浓度大于9%时,醋酸菌C-3-2-1的产酸量最高,酒精转化率最高;当温度为42 ℃时,醋酸菌D-3-4和R-4-2仍有30 g/L的产酸量;当乙酸浓度大于30 g/L时,醋酸菌D-3-4与C-3-2-2的产酸量在各菌株中最高;综合各性能比较得出醋酸菌D-3-4性能最优,为优势高产酸醋酸菌。

镇江香醋,醋酸菌,分离

食醋作为一种食品调味品,在人们的日常生活中扮演着重要的角色。其以谷物蔬果为原料,在多种有益菌的参与下,历经淀粉糖化,酒精发酵和醋酸发酵[1-2]三个阶段发酵而成,具有较高的营养价值。醋酸菌在食品工业中具有重要作用,尤其是在食醋生产过程中起着关键作用[3-4]。分离潜在的醋酸菌在持续探索新的优良菌株和改进其生物性能方面是十分必要的。

除了产酸能力外,近年来有关工业发酵醋中醋酸菌的耐受力的研究又重新得到关注,醋酸菌对温度、酒精、醋酸的耐受性直接影响着醋酸的产量,与经济效益息息相关[5]。目前醋酸菌对热、乙酸、乙醇和糖的耐受性研究已有初步研究[6-8]。夏季由于温度较高的原因,常常导致醋酸发酵速率急速下滑,食醋生产受到严重影响,且发酵成本成倍提升[9]。另外,醋酸菌将乙醇氧化为乙酸的过程中会出现高浓度乙醇底物抑制和高浓度醋酸产物抑制的问题,从而影响醋酸菌的生长和产酸活性,甚至发生过氧化反应,降低产酸量[10]。因此,优良的醋酸菌应具备高效氧化酒精的酶系,以及耐高酸、耐高温及高产酸的性能。

镇江香醋属于四大名醋之一,其天然发酵的醋醅中存在大量的优良醋酸菌。因此,本实验以镇江恒顺香醋发酵过程中的醋醅为原料,分离筛选产酸菌,并进行生物学鉴定和产酸及耐温度、耐酒精、耐乙酸等耐受力测定,以期得到性能优良的优势醋酸菌菌株,不仅能丰富食醋行业的优质醋酸菌库,而且也能为研究开发新醋奠定良好的基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

样品来源以镇江恒顺香醋厂醋酸发酵第3 d的醋醅为实验样品;蛋白胨,酵母提取物,购自Oxoid公司;葡萄糖,琼脂,酒精,NaOH,无水乙醇,冰醋酸,溴甲酚紫,酚酞国药集团化学试剂有限公司。

BS2000S电子天平北京赛多利斯仪器有限公司;HVE-50立式压力蒸汽灭菌器HIRAYAMA公司;VS-1300-U超净工作台江苏省苏州净化设备有限公司;PSX-280H恒温恒湿培养箱宁波莱福科技有限公司;BS-2FD双层立式全温培养摇床苏州威尔实验用品有限公司。

1.2实验方法

1.2.1培养基的制备平板分离培养基[11]:葡萄糖1%,蛋白胨0.3%,酵母提取物1%,琼脂1.8%,0.04%溴甲酚紫5%,pH 6.8左右,121 ℃ 0.1 MPa灭菌20 min,等温度降到55 ℃左右时加入无水乙醇3%(v/v)。

基础发酵液体培养基[12]:葡萄糖1%,蛋白胨0.3%,酵母提取物1%,pH6.8左右,121 ℃ 0.1 MPa灭菌20 min,等温度降到55 ℃左右时加入无水乙醇3%(v/v)。

斜面保藏培养基[11]:葡萄糖1%,蛋白胨0.3%,酵母提取物1%,琼脂1.8%,pH 6.8左右,121 ℃ 0.1 MPa灭菌20 min,等温度降到55 ℃左右时加入经过了灭菌的无水乙醇3%(v/v)。

1.2.2产酸菌分离鉴定步骤取样→稀释涂布→分离纯化→挑取单菌落→形态观察→菌悬液制备→16S rDNA分子鉴定→斜面保藏

1.2.2.1产酸菌的分离称取10 g醋醅样品,放入事先灭菌的250 mL三角瓶中(装有玻璃珠和90 mL无菌水),125 r/min振荡20 min后静置2 min,得到10-1的菌悬液,用无菌水以10-2、10-3、10-4梯度稀释,分别取0.2 mL的10-3和10-4梯度于分离培养基平板上,每个浓度涂布三块平板,以溴甲酚紫为指示剂[11]。于28 ℃倒置培养2～3 d。根据菌落周围有无黄色圈来判断是否产酸。

1.2.2.2产酸菌的纯化挑取透明圈较大且长势良好的单菌落,在分离培养基平板上划线分离纯化,4 ℃冰箱保存,用于进一步分子鉴定[11]。

1.2.2.3产酸菌的鉴定产酸菌送至上海生工,选用细菌16S rDNA的通用引物27F和1492R进行测序[13],根据提供的检测结果中的16S rDNA 基因序列,在Genbank数据库中找到同源性最大的相关菌种,之后进行系统发育分析,利用MEGA6.06对所得到的DNA序列进行同源性比对,并构建其BioNJ进化树。

1.2.3醋酸菌产酸量定性实验方法分别挑取已鉴定的产酸菌单菌落接入基础发酵液体培养基中,30 ℃、150 r/min培养,分别取发酵液用分光光度计测OD600,调整OD600=1,然后分别吸2 μL于两块溴甲酚紫显色平板上,培养2～3 d后对比透明圈大小,以此判断是否产酸以及初步估计产酸量大小。

1.2.4醋酸菌产酸定量实验方法将相同浓度的醋酸菌液分别接种于100 mL基础发酵液体培养基中,在35 ℃、150 r/min的条件下摇床培养。72 h后取出发酵液,用碱式滴定法检测每株菌的具体产酸量,取10 mL发酵液,滴定前在发酵液中滴加2～3滴酚酞指示剂。用0.1% NaOH标准液滴定,由消耗的NaOH溶液的量来计算醋酸菌产酸量。产酸量计算公式为:

(1)

式中:V=发酵液样品滴定所耗的NaOH标液毫升数;V0=对照组(空白培养基)滴定所耗的NaOH标液毫升数;60=醋酸的摩尔分数质量。

1.2.5耐酒精性能测定方法将菌体浓度相同的各株醋酸菌液以10%接种量分别接入五个酒精浓度梯度的发酵培养基中,分别为:5% Vol、7% Vol、9% Vol、11% Vol、13% Vol,35 ℃、150 r/min的摇床中震荡培养4 d。取10 mL发酵液,测定产酸量。同时计算不同酒精浓度下酒精转化率的大小。

酒精转化率计算公式[14]:

(2)

1.2.6耐温性能测定方法将菌体浓度相同的各株醋酸菌以10%接种量分别接入发酵培养基中,设定发酵梯度温度分别为26、30、34、38、42 ℃,150 r/min的摇床中震荡培养4 d。取10 mL发酵液,测定产酸量。

1.2.7耐乙酸性能测定方法将菌体浓度相同的各株醋酸菌以10%的接种量接入100 mL含不同浓度乙酸的发酵培养基中,乙酸的浓度梯度为10 g/L Vol、20 g/L Vol、30 g/L Vol、40 g/L Vol、50 g/L Vol,每个菌株设定3个平行实验,35 ℃、150 r/min的摇床中震荡培养4 d。取10 mL发酵液,测定产酸量。

1.3数据处理

所有实验数据均重复测定3次,结果与平均值±标准偏差(X±SD)来表示,实验的数据采用Excel统计分析软件来进行处理。

2　结果与讨论

2.1产酸菌的分离纯化结果

当溶液pH在5.2～6.8之间,溴甲酚紫的颜色由黄色变为紫色,所以可作为产酸指示剂。其常用浓度为0.04%[15],颜色变化明显。Swings[16]等于1992年将该方法列入醋酸菌的表征中。这种方法简便易操作,极易在平板上观察到产酸反应,便于分离产酸菌。

将醋醅样品的菌悬液梯度稀释后,涂布于分离培养基平板上,由于具有产酸菌特性的菌株,在溴甲酚紫平板上生长过程中释放酸,酸可以使平板上紫色的溴甲酚紫变为黄色,使菌落周围的培养基呈黄色的变色圈。根据产酸菌的分离方法得到产酸菌菌落(图1)。挑取长势良好的单菌落,划线分离,初步分离得到20个产酸单菌落,再经28 ℃恒温培养2 d后,得到17个产酸菌菌落,再挑取其上黄色圈明显、形态完整的单菌落再进行分离,再次分离后得到黄色圈较大的15个单菌落。

图1　溴甲酚紫显色平板上的产酸菌菌落形态Fig.1　The colony morphology of acid producing bacterium on GYEC plates

2.2产酸菌的鉴定结果

由于传统的细菌鉴定方法,即观察菌株形态、分析菌株的生理学特征,存在一些缺点,如耗时费力,且结果不够准确[17],而16S rDNA序列分析方法快速且准确,是非常有用的细菌鉴定方法。Sievers和Swings[18]于2005年构建了醋酸菌科的近乎完整的16S rDNA序列的系统发育树,详见第二版的伯杰氏系统细菌学手册。因此,16S rDNA序列分析方法可以作为醋酸菌分类鉴定的强有力工具[19-21]。

将15株产酸菌进行16S rDNA鉴定,鉴定结果显示其中8株为醋酸菌,将它们分别命名为:D-3-4、D-3-1、C-3-2-1、R-4-2、C-3-2-2、C-3-1-1、C-4-1-1、D-3-5。Hagstrom[22]将16S rDNA序列相似度为97%的判定为一个种,所以这8株都可以鉴定到种。

根据测序结果,用16S rDNA测序序列构建系统发育树,如图2所示。NJ进化树的自举检验值均大于50,同源性的拓扑结构正确。8个菌株在Blast检测后显示出为巴氏醋酸杆菌但菌株R-4-2所属亚种与其余7种不相同,D-3-4也在亚种上与其余菌种有较大区分。

图2　分离菌株的N-J系统发育树Fig.2　The phylogenetic tree of isolated strainsby N-J method

2.3醋酸菌产酸量定性实验结果

平板分离培养基,已被认为是一种理想的分离产酸菌的培养基[11,19]。采用溴甲酚紫作为产酸指示剂,根据黄色变色圈的大小,可以初步判断产酸量的多少。对8株醋酸菌进行产酸定性实验测定,结果如图3所示。由图可知,D-3-4、D-3-1、C-3-2-1、D-3-5与R-4-2的产酸透明圈较为明显、边缘整齐且较大,由此初步判定这5株醋酸菌的产酸量较大;而C-3-2-2、C-3-1-1与C-4-1-1透明圈较为不清晰。

图3　分离菌株在溴甲酚紫显色平板上的产酸透明圈Fig.3　The transparent circle on GYEC plates created by isolated strains

2.4醋酸菌产酸量定量实验结果

对8株醋酸菌进行产酸量的测定,结果如图4所示,其中最高产酸量大于60 g/L(D-3-4),最低产酸量小于40 g/L(D-3-5、C-3-1-1、C-4-1-1)。邵向丽[23]等对醋醅中优良醋酸菌株筛选的研究中发现,巴氏醋酸杆菌的产酸量最高为55.51 g/L,最低为32.40 g/L;张烨和张磊[24]对山西老陈醋优势醋酸菌菌株的研究发现,产酸量最高为67.88 g/L,最低为42.84 g/L。因此,认为菌株D-3-4为高产酸醋酸菌;C-3-2-2、D-3-1、C-3-2-1、R-4-2的产酸量均高于40 g/L,为产酸较高的醋酸菌;而D-3-5、C-3-1-1与C-4-1-1为普通产酸醋酸菌。总的来说,我们所筛选出的醋酸菌产酸量较高,特别是D-3-4。

图4　醋酸菌的产酸量Fig.4　Acetic acid production of isolated strains

2.5醋酸菌的耐性实验结果

2.5.1醋酸菌的耐酒精性能醋酸菌能够高效地将高浓度的酒精氧化,是生产高浓度酸的必备条件。但是,较高初始浓度的酒精会抑制醋酸菌生长,使得乙醇转化率和产酸的速率下降,导致发酵周期延长数倍,使整个醋酸发酵效率严重降低。对不同酒精浓度下醋酸菌的产酸量和对酒精的转化率进行测定,其结果分别如图5、图6所示。由图可知,各醋酸菌在酒精浓度为5%产酸量最大,酒精转化率最高,随着酒精浓度的增加,产酸量呈下降趋势,酒精转化率下降。D-3-4在酒精浓度为5%、7%时产酸量最高,酒精转化率最高,但当酒精浓度为9%时出现较大的下降。C-3-2-1和C-3-2-2在酒精浓度为5%、7%时的产酸量仅小于D-3-4,当酒精浓度大于等于9%时,C-3-2-1的产酸量在各菌株中最高。D-3-5在各酒精浓度下,产酸量都很小,酒精转化率也很小。R-4-2、D-3-1、C-3-1-1和C-4-1-1在各酒精浓度下的产酸量在各醋酸菌处于中等水平,酒精转化率也处于中等水平。

图5　不同菌株在不同酒精浓度下的产酸量Fig.5　Growth of different strainsat different alcohol concentration

图6　不同菌种在不同酒精浓度下的酒精转化率Fig.6　The alcohol conversation rate of different strains at different concentration

同时,通过图5和图6可以看出,最高能够耐受13%的酒精浓度,在酒精浓度为9%时,虽然产酸量下降,但是仍有15%的产酸量。而在酒精浓度为5%、7%时产酸量最高,酒精转化率也最高。2013年Yuan Yi[20]等研究从恒顺香醋发酵中分离的耐酒精醋酸菌,能够耐受7%的酒精浓度。由于产酸速率的快慢,反应了酒精转化率的高低,也影响着发酵周期的长短。因此在生产中采用产酸速率较高的菌株,从而缩短发酵时间,提高醋酸的产率。由此可见,我们选出的菌株总体上在产酸量高的同时,还能耐受高浓度的酒精,尤其是菌株D-3-4,可以进一步对其开发应用于生产上。

2.5.2醋酸菌的耐温度性能醋酸菌在30～35 ℃均能良好生长,但不同菌属的醋酸菌具有不同的最适温度。温度过高会使醋酸菌菌体老化加快,产酸速率降低,甚至导致菌体死亡[25]。对醋酸菌在不同温度下的产酸量进行测定,其结果如图7所示,由图可知,在26～42 ℃的温度范围内,各醋酸菌的产酸量随着温度的上升先增加后下降。D-3-4与C-3-2-2在34 ℃时产酸量最高,34 ℃可能是它们生长的最适温度。R-4-2与C-3-2-1在30 ℃时的产酸量最高,30 ℃可能是它们生长的最适温度。C-4-1-1在38 ℃时与34 ℃时具有几乎相同的产酸量,说明该菌株具有较宽的培养温度范围。当温度为38 ℃,D-3-4和C-2-2的产酸量在各菌株中最高;当温度为42 ℃时,R-4-2、D-3-4仍能有30 g/L的产酸量,表现出较好的耐高温性。

图7　不同菌株在不同温度下的产酸情况Fig.7　Aciduricity of different strains at different temperature

恒顺香醋醋酸发酵过程中温度为40～46 ℃[26],而醋酸菌的最适生长温度是25～30 ℃,如果通过降低醅温来达到醋酸菌最适发酵温度,需要很高的制冷费,这不利于工厂的效益。因此,选育耐高温的、产酸量高的醋酸菌有着显著的经济效益。从本实验可以看出,分离出的D-3-4、R-4-2,可进一步对其驯化培养,得到更优良的耐高温菌株。

2.5.3醋酸菌的耐乙酸性能醋酸菌具有复杂的耐酸机制[10],在受多基因控制的同时,还有多种物质的交叉调节机制,乙酸在过量时,醋酸菌将失去氧化乙醇的能力,以及对乙酸的抗性迅速减弱,最终导致终产物醋酸的累积不足,醋酸菌的产酸性能大受影响。对醋酸菌在不同乙酸浓度下的产酸量进行测定,结果如图8所示,除C-3-2-1和C-4-1-1在乙酸浓度为20 g/L时产酸最高外,其余菌株在乙酸浓度为10 g/L时产酸量最高。在各乙酸浓度下,D-3-4的产酸量在各菌株中均最高,当乙酸浓度为10 g/L时,D-3-4的产酸量最高,可达41.2 g/L。当乙酸浓度超过30 g/L时,各菌种的产酸量均出现骤降的现象,D-3-4和C-3-2-2的产酸量在各菌株中最高,当乙酸浓度为50 g/L时,D-3-4和C-3-2-2的产酸量为5 g/L,说明D-3-4和C-3-2-2在耐乙酸方面具有一定的潜力。

图8　不同菌株在不同乙酸浓度下的产酸情况Fig.8　Aciduricity of different strainsat different aceticacid concentratio

朱瑶迪[9]等研究发现,恒顺香醋醋酸发酵过程中,随着发酵时间的增加,乙酸的浓度逐渐增加,从开始的接近0的酸度,到最后结束的61.2 g/L。本研究中,是直接在起始培养液中加入不同浓度的乙酸,菌株D-3-4和C-3-2-2没有经过酸度的驯化,仍然能在50 g/L的乙酸浓度下,生长产酸,可见它们有较强的耐乙酸能力,因此,可用来作为优势醋酸菌株,进一步对其开发应用。

3　结论

本研究从恒顺醋醅中分离鉴定出8株巴氏醋酸杆菌。利用产酸量对这8株菌株研究发现,菌株D-3-4产酸量达到60 g/L,为高产酸菌株;进一步通过产酸性能研究发现,菌株D-3-4能够耐受9%的高浓度酒精,42 ℃的高温,以及50 g/L的高浓度乙酸,而且在这样的条件下,还能够有一定的产酸量。综合产酸以及耐酒精、耐温度、耐乙酸等比较,发现醋醅中筛选得到的醋酸菌D-3-4的性能最好,为优势高产酸醋酸菌菌株。

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Screening of acetic acid bacteria with high yield of acid from vinegar pei of Zhenjiang aromatic vinegar

ZHANG Zhi-yan1,2,QIAN Jing-ya1,MA Zhen1,ZHANG Zheng-pei1,YU Xiao-chen1,MA Hai-le1,*

(1.School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China;2.Institute of Life Sciences,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

Zhenjiang aromatic vinegar is traditionally fermented vinegar in China and bears valuable nutritions.In this study,acetic acid bacteria(AAB)with high yield of acetic acid were investigated by screening from vinegar Pei of Zhenjiang aromatic vinegar.Fifteen strains of producing acid bacteria were isolated and eight strains of AAB were identified by 16S rDNA sequencing analysis.Among these eight strains,strain D-3-4 had a higher ability to produce acetic acid,reaching 60 g/L.The results of resistance testing to alcohol,temperature and acetic acid showed that the strain D-3-4 had the highest yield of acid when alcohol concentration was no more than 9%;but strain C-3-2-1 had the highest yield of acid and a conversion efficiency of alcohol when alcohol concentration was more than 9%.The study of thermo-tolerance demonstrated that strains D-3-4 and R-4-2 still had higher ability to yield acid,reaching 30 g/L at 42 ℃.The experiment of resistance to acetic acid showed strains D-3-4 and C-3-2-2 had the highest yield of acid at 30 g/L acetic acid concentration.Totally,the acid production of strain D-3-4 was superior to other strains.Therefore,the strain D-3-4 was finally selected as the dominant AAB of high production.

Zhenjiang aromatic vinegar;acetic acid bacteria;isolation

2015-10-12

张志燕(1977-)，女，博士研究生，助理研究员，研究方向：微生物发酵和食品生物技术，E-mail:yanziljh@163.com。

马海乐(1963-)，男，博士，教授，研究方向：功能食品与食品加工，E-mail:mhl@ujs.edu.cn。

TS201.3

A

1002-0306(2016)11-0174-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.028