坚果果壳中活性物质体外抗氧化活性研究进展

许莹莹,张　宇,肖康曼,范泽琨,李德海

(东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨 150040)



坚果果壳中活性物质体外抗氧化活性研究进展

许莹莹,张宇,肖康曼,范泽琨,李德海*

(东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨 150040)

作为坚果副产物的坚果果壳资源丰富,且富含多糖、多酚、黄酮等功能性成分,具有重要的开发价值。研究表明,坚果果壳提取物具有显著的抗氧化活性,可以清除体内自由基,减缓衰老,是开发天然抗氧化剂的优质资源。本文主要对坚果果壳中抗氧化活性物质体外抗氧化活性研究的重要性、各种研究方法的基本原理及应用情况进行了讨论,为坚果果壳抗氧化物质的开发利用提供参考。

坚果果壳,活性物质,抗氧化活性,体外抗氧化评价

近年来坚果由于含有丰富的不饱和脂肪酸、功能性多糖、功能性脂肪酸而倍受青睐,而作为副产物的坚果果壳资源也越来越丰富,其开发利用及功能性研究也越来越多。坚果果壳因其坚硬而不被利用,不仅造成资源浪费,而且污染环境。研究表明,坚果果壳中富含多糖、多酚、黄酮等活性物质,具有抗氧化、抗肿瘤和抑菌性等功能[1]。目前关于坚果果壳提取物抗氧化活性研究较多,那么正确评价抗氧化活性的指标显得尤为重要。抗氧化功能评价指标主要有体内抗氧化活性测定和体外抗氧化活性测定,其中坚果果壳提取物抗氧化功能评价方法主要以各项体外抗氧化指标为主。体外抗氧化活性研究方法的反应原理包括自由基参与的质子转移反应及离子参与的电子转移反应,其中质子转移反应范围较广,电子转移反应对试剂底物之间的关系比较敏感,两者必须满足氧化还原反应才进行测定。位于人体中的自由基活跃不稳定,容易引起体内细胞的癌变和凋亡,所以对于食品行业自由基的清除率测定必不可少,常与酶法、非酶法及实验仪器结合使用。自由基清除率的大小与参与反应的有机物质结构有关,清除率大小与反应物浓度有很好的线性关系。因此本文主要对坚果果壳抗氧化活性物质体外抗氧化评价的重要性,各种方法的基本原理,应用情况进行讨论,为坚果果壳抗氧化活性物质的开发研究提供理论参考。

1　坚果果壳活性物质体外抗氧化活性研究的重要性

体外抗氧化活性研究在坚果果壳活性物质应用中起着举足轻重的作用。在生物体系中,抗氧化大分子、抗氧化小分子以及酶的总体水平反映了总体抗氧化能力的大小。而在实际研究中,抗氧化物质的抗氧化能力主要以对活性自由基清除能力的大小来衡量,活性氧自由基主要包括羟基自由基、超氧自由基和过氧化氢等。因此,在抗氧化活性物质的研究与开发过程中,抗氧化活性指标的选择与研究尤为重要,尤其是抗氧化活性物质的初期功能评价与筛选中,体外抗氧化活性研究由于简便和直接而受到研究者的青睐和重视。目前提取坚果果壳活性物质实验中,要想进一步实验提取物质的实用性,体外抗氧化活性研究是实验的基础。鲁晓翔等[2]提取板栗壳多酚,进行了DPPH·清除率的测定、OH·清除率的测定,初步确定板栗多酚具有较强的抗氧化性。王振宇等[3]利用体外抗氧化活性研究方法实验了榛子壳中不同提取条件对提取物抗氧化能力的影响,初步确定了榛子壳抗氧化提取物的最佳提取条件。Ana Cristina Pinheiro do Prado等[4]通过DPPH·清除率、ABTS+·清除率等方法初步确定了美洲山核桃壳提取物具有较好的抗氧化性。Soong YY等[5]从龙眼壳中提取氨基酸物质进行了体外抗氧化检测,发现龙眼壳的抗氧化性强于果肉。Yen等[6]提取花生壳中的木犀草素和多酚类物质,通过体外抗氧化研究发现其有抗氧化活性。Wei等[7]通过体外抗氧化活性研究,发现苦杏壳中的焦木酸具有抗氧化活性。可以看出,通过体外抗氧化活性研究,可以快速确定坚果果壳提取物的抗氧化功能、抗氧化物质提取条件,进行不同物质的抗氧化性比较等,为进一步深入研究坚果果壳提取物抗氧化功能奠定基础。

2　坚果果壳活性物质体外抗氧化活性的研究方法

2.1坚果果壳活性物质还原力评价方法的研究

还原力的测定原理依据的是物质提供电子能力的大小,除可与氧化性物质反应外还可与自由基反应。目前,总还原力测定最常用普鲁士蓝法,赤血盐生成黄血盐后,再利用Fe2+生成普鲁士蓝,在700 nm处测得吸光值。吸光值的测定可用分光光度计与酶标仪进行,分光光度计可用于检测最大吸光值波峰不同溶液的吸光值,对溶液体积要求较高,酶标仪适用于最大吸光值波峰相近的溶液,对溶液体积要求较小,一般为几百微升。此外还有循环伏安法,总酚测定,FRAP法,特殊金属离子还原法(例如铜离子)。Arrabal C等[8]通过研究发现,松属植物中富含酚类,生物碱类等物质,并对其还原性进行了探究。刘秀湘等[9]发现橡实壳中的天然黄酮类色素具有还原性,现已在生产上广泛使用。胡明明[10]对花生壳多酚物质采用铁氰化钾法测定了还原力,用BHT作阳性对照,花生壳纯多酚还原力大于BHT。通过还原力评价可以确定坚果果壳提取物的自身的还原作用,成为比较不同提取方法获得提取物体外抗氧化活性研究的首选方法。

2.2坚果果壳活性物质对DPPH·清除率评价方法的研究

DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基为以有机氮为中心的脂溶性自由基,比较稳定,不属于体内自由基,在517 nm左右有最大吸收峰。以苯酚为例DPPH·清除的反应原理如下:

ArOH+DPPH·→ArO·+DPPH·H

式(1)

ArO·+DPPH·→产物

式(2)

其中式(1)为H原子转移反应,式(2)为电子转移反应:抗氧化剂与孤电子配对,溶液褪色,光吸收强度减弱[11],DPPH·的结构如图1所示。

图1　DPPH·的结构图Fig.1　The structure of DPPH·

抗氧化剂的结构、性质、溶解性、分配系数、溶剂系统决定主反应机制,由于在极性溶液中易呈氢键,易发生电子转移反应,而在非极性溶液中更容易发生H原子转移反应。DPPH法因其稳定性好,灵敏度高,设备要求不高而成为检测抗氧化能力的首选[12-13]。常用乙醇及甲醇做提取剂,DPPH·溶于溶剂呈深紫色,加入抗氧化剂颜色变浅,化合物的自由基清除效率通过DPPH·的脱色确定[14],此法对抗氧化能力有较高要求,需要通过实验寻找适当的浓度范围。Rathee等[15]发现用甲醇提取的黄果叶花蕾提取物的抗氧化活性优于乙醇,但是由于甲醇具有一定毒性,所以实验室常用乙醇提取。检测DPPH·清除率最常用分光光度计法,近年来,高效液相色谱技术、电子核磁共振技术、薄层层析技术也常用于DPPH·清除率的检测。抗氧化剂空间位阻效应是决定性因素,位阻大反应越难进行,反应时间增加。分光光度计法测DPPH·清除率的公式为:

DPPH·清除率(%)=(1-AS/A0)×100

其中AS为样品管的吸光值;A0为对照管的吸光值。

赵萍等[16]通过利用此方法证明了葵花籽壳黑色素具有抗氧化活性,且其纯化后的抗氧化活性略低于维生素C,高于没食子酸。王晓樱等[17]发现苦杏仁焦油中的DPPH·清除率与其浓度大小有关,在质量浓度0.02～0.08 mg/L下DPPH·清除率呈现上升趋势。孙文凯[18]发现芡实壳乙醇提取物的DPPH·清除率大于水提产物,DPPH·清除率达到50%以上时,DPPH·清除率大小与浓度大小相关性较小,几乎不变。黄迪惠[19]发现莲子壳黄酮纯化后的DPPH·清除率高于BHT。DPPH可以有效地清除体内的自由基,通过褪色程度快速定量的分析清除自由基能力的大小,广泛用于定量分析生物试剂和食品抗氧化功能评价。

2.3坚果果壳活性物质对OH·清除率评价方法的研究

Fenton反应是产生OH·的主要原因,利用Fe2+离子螯合作用螯合抗氧化剂,游离Fe2+与Fenton试剂生成物在562 nm下有强吸收能力的显色基团,间接反映抗氧化性。目前用于研究的方法有电子自旋共振法、化学发光法、高效液相色谱法及分光光度法等,生物学上常用结晶紫法和脱氧核糖法[20],抗氧化剂用量与OH·清除能力呈正比,一般以水杨酸作为捕捉剂,最大吸收波长为510 nm,自由基清除率计算公式为:

OH·清除率(%)=[(A0-AS)/A0]×100

式中,A0为空白管的吸光度,AS为加入自由基清除剂后的吸光度。

OH·是公认的体内危害最大的自由基,可与体内的脂肪等有机物大分子发生连续反应,所以OH·清除率测定在坚果壳活性成分体外抗氧化测定中是必不可少的,几乎所有的实验都有涉及。OH·清除率测定对实验技术要求高,当以VC为标准品时,其清除率并不高,所用药品现配现用,水杨酸很容易变红色,影响实验效果。清除率不会超过100%,实际测试中常会出现大于100%的情况,应多设置几组平行组。陶希婧等[21]通过水提法提取榛子壳色素并通过此项测定发现色素浓度增加,OH·清除率越高,抗氧化性越强。张海悦和张守媛[22]提取葵花籽壳中的色素通过OH·清除率测定发现色素黄酮浓度大于8.0 mg/L,OH·清除率低于水杨酸。阎娥等[23]通过对蚕豆壳中的原花青素进行OH·清除率测定发现其抗氧化能力较强,最高可达92.00%。胡博路和杭瑚[24]采用石油醚提取核桃壳中的活性物质并进行OH·清除率测定,得出半数清除率为3.70 mg/mL。OH·是一种重要的活性氧自由基,具有强氧化性,对细胞具有攻击性,常用OH·清除率研究病变原因,比较延缓衰老能力的大小。

2.4坚果果壳活性物质对ABTS+·清除率评价方法的研究

ABTS[2,2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]具有还原性,易被氧化成相对稳定的蓝绿色水溶性ABTS+·,ABTS+·与抗氧化剂反应后溶液褪色,褪色越强,吸光值越低。溶液退色程度与溶液的抗氧化能力呈正比。ABTS+·的还原电势为0.68 V,只要化合物低于此电势即可将ABTS+·还原,所以当化合物还原电势高于0.68 V时,此法效果不明显。对于脂溶性抗氧化物质检测不明显,一般常用于水溶性抗氧化物质的检测。此法操作费时,储备液配好后需要过夜才可应用,该储备液对温度和pH要求比较严格,一般为30 ℃、734 nm波长下的吸光度为0.7±0.02。需要避光反应才可进行吸光值测定。在414 nm或734 nm处有强吸收峰,测量结果用当量抗氧化能力表示。ABTS+·清除率常用计算公式:

ABTS+·清除率(%)=(1-AS/A0)×100

其中AS为样品管的吸光值;A0为对照管的吸光值。ABTS+·的分子结构如图2所示。

图2　ABTS+·的结构图Fig.2　The structure of ABTS+·

刘薇等[25]对ABTS+·清除率与邻二氮菲-Fe3+法检测抗氧化能力做了比较,发现ABTS+·可运用的范围更广,邻二氮菲-Fe3+只可用于还原电位低于Fe3+的物质,而且Fe3+被氧化成Fe2+后与邻二氮菲反应,所以灵敏度较ABTS+·清除率法低。水溶性物质对水溶性ABTS+·的抑制效果好于脂溶性DPPH·,DPPH·清除率的半数抑制浓度高于ABST+·清除率的半数抑制浓度,ABST+·反应时会结合羟基化的芳香族化合物而影响其实际抗氧化活性。

苏晓雨[26]通过对红松壳多酚ABTS+·清除率的测定发现,其红松壳多酚抗氧化性低于维生素C,清除率可高达95%。在0～1.0 mg/mL浓度范围内,ABTS+·清除率大小与浓度呈正相关性。臧盛[27]测定了糜子壳多酚的ABTS+·清除率,糜子壳多酚主要为黄酮类物质,得出不同品种的糜子壳,不同颜色的糜子壳ABTS+·清除率大小存在明显差异,颜色越偏褐色,黄酮含量越高,ABTS+·清除能力越强。蒙琦[28]发现松塔多糖可以螯合一定浓度的Fe2+,具有清除ABTS+·的作用。ABTS+·清除率用于检测游离氯以及过氧化物酶底物的多少,比较不同提取方法,提取条件抑制活性氧生成能力的大小,从而对坚果果壳活性物质进行抗氧化活性研究。

其中,A1为实验组吸光值;A2为对照组吸光值;A3为空白组吸光值。

3　坚果果壳活性物质其他体外抗氧化活性的研究方法

坚果果壳活性成分除了以上体外抗氧化研究方法外还会常用到DMPD法、TRAP法、ORAC法、FRAP法、硫氰酸盐法、硫代巴比妥酸法、抗油脂氧化值及对猪油的抗氧化值等。DMPD法根据自由基的清除能力来评价其抗氧化力,FRAP法和TRAP法根据物质对铁离子的还原能力进行比较分析,测量结果以FeSO4浓度表示,以FRAP法为例在593 nm处有最大吸光值,反应过程可用下列方程表示:

Fe3+-TPTZ→Fe2+-TPTZ(蓝色)

ORAC法与FRAP法和DPPH法测量结果相关性较小,不宜同时使用,FRAP法与ABTS法具有很好的相关性[33],硫代巴比妥酸法检测不饱和脂肪酸氧化产物醛类,以丙二醛为主。总之,实际应用中常几种体外抗氧化方法结合使用。周德龙等[34]采用硫代硫酸钠法对莲子壳的营养成分进行抗油脂氧化性评估,并测定了黄酮的抗氧化性,得出莲子壳黄酮具有调节人体代谢,增强细胞免疫力的作用。刘晓丽等[35]从花生壳中提取了多酚类物质发现其对猪油、花生油、葵花籽油具有抗氧化作用,对花生油的抗氧化作用相当于茶多酚。

4　结论与展望

体外抗氧化检测操作简单,用时短,效果明显,能够定量表示检测结果,应用较广,但是,由于体外抗氧化活性研究方法多种多样,采用不同的评价方法很难找到统一性,所以体外抗氧化活性的评价标准有待进一步研究。体外抗氧化活性测试常与毒理实验连用,体外抗氧化测试将广泛用于新材料、新原料的初级检验,坚果果壳提取物要用于食品领域必须进行这两项检测。随着人们对高质量生活的追求,对保健产品的依赖,体外抗氧化活性研究将成为检验食品是否具有保健功能的一项必测指标。坚果果壳提取物质应用于化工领域,生产抗衰老性护肤用品,体外抗氧化活性研究将成为产品的抗衰老功能评价标准。

[1]吕永俊,王士贤,彭芳,等. 松果有效成分研究、红松与油松松塔及松子壳的抗癌活性[J].大理学院学报,2008,7(2):1-2.

[2]鲁晓翔,赵晨光,连喜军. 板栗壳多酚提取条件及其抗氧化性研究[J]. 食品研究与开发,2008,29(3):32-35.

[3]李德海,刘荣,王振宇. 提取条件对榛子壳提取物抗氧化活性的影响[J]. 中国酿造,2011,237(12):126-129.

[4]Ana Cristina Pinheiro do Prado,Bruce A Manion,Koushik Seetharaman,et al. Relationship between antioxidant properties and chemical composition of the oil and the shell of pecan nuts[Caryaillinoinensis(Wangenh)C. Koch][J].Elsevier Journal,2013,45:64-73.

[5]Soong Y Y,Barlow P J. Quantification of gallic acid and ellagic acid from longan seed and mango kernel and their effects on antioxidant activity[J].Food Chemistry,2006,97:524-530.

[6]Yen G C,Duh P D. Antioxidant activity of methanolic extracts of peanut hulls from various cultivars[J]. J of the American Oil Chemists’ Society,1995,72(9):1065-1067.

[7]Wei Q,Ma X H,Zhao Z,et al. Antioxidant activities and chemical profiles of pyroligneous acids from walnut shell[J]. Journal of Analytical and Applied Pyrolysis,2010,88(2):149-154.

[8]Arrabal C,Cortijo M,Simon B F,et al. Differentiation among Five Spanish Pinus Pinaster Provenance Based on Its Oleoresin Terpenic Composition[J]. Biochemical Systematics and Ecology,2005,33:1007-1016.

[9]刘秀湘,余仲元,陈宗元. 橡子壳色素研究[J].林产化学与工业,1994,14(4):64-68.

[10]胡明明. 花生壳多酚的提取、纯化及其抗氧化、抑菌活性研究[D]. 南昌:南昌大学,2012.

[11]Saito K,Jin D H,Eiko Hatakeyama,et al. Antioxidative properties of tripeptide libraries prepared by the combinatorial Chemistry[J]. J Agric Food Chem,2003,51(12):3668-3674.

[12]Maya Chochkova,Boyka Stoykova,Galya Lvanova,et al. N-Hydroxycinnamoyl amides of fluorinated amino acids:Synthesis,anti-tyrosinase and DPPH scavenging activities[J]. Journal of Fluorine Chemistry,2013,156(10):203-208.

[13]OZCELIK B,LEE J H,MIN D B. Effects of light,oxygen and pH on the absorbance of 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl[J]. Journal of Food Science,2003,68(2):487-490.

[14]Massimo Moretti,Lina Cossignani,Federica Messina,et al. Antigenotoxic effect,composition and antioxidant activity of Dendrobium speciosum[J]. Food Chemistry,2013,140(4):660-665.

[15]Rathee JS,Hassarajani SA,Chattopadhyay S.Antioxidant activity of Mammea longifolia but extracts[J].Food Chemistry,2006,99:436-443.

[16]赵萍,王雅,魏明广,等. 葵花籽壳黑色素提取鉴定及抗氧化性研究[J].食品工业科技,2012,33(22):133-140.

[17]王晓樱,尉芹,赵忠,等. 苦杏壳木焦油蒸馏液的抗氧化活性研究[J].西北林学院学报,2014,29(1):111-115.

[18]孙文凯. 芡实壳提取物抗氧化作用与降血糖功效初探[D]. 合肥:合肥工业大学,2012.

[19]黄迪惠. 莲子壳黄酮的分离纯化、结构及抗氧化活性研究[D]. 武汉:华中农业大学,2009.

[20]Kitts DD,Yuan YV.Antioxidant activity of the flaxseed lignan secoisolariciresiol didycoside and its mammlian metabolites enterodiol and enterolactone[J].Mol Cell Biochem,1995,23(90):177-182.

[21]陶希婧,苏明升,刘言佳,等. 榛子壳棕色素的提取及抗氧化活性和抑菌性的研究[J].中国食品添加剂,2013(2):116-120.

[22]张海悦,张守媛. 响应面优化黑葵花籽壳中黄酮的提取及抗氧化性研究[J]. 中国酿造,2011,234(9):152-155.

[23]阎娥,刘建利,原江锋. 蚕豆壳中原花青素的提取及抗氧化性研究[J].食品工业科技,2009,30(2):65-67.

[24]胡博路,杭瑚.核桃壳抗氧化和清除活性氧自由基的研究[J].食品工业科技,2002,23(3):15-16.

[25]刘薇,邱乐,杨婧,等. ABTS与邻二氮菲-Fe3+法测定保健食品抗氧化能力比较分析[J].食品工业,2013,34(3):120-123.

[26]苏晓雨. 红松种壳组成及多酚提取分离与抗氧化抗肿瘤功能研究[D]. 哈尔滨:哈尔滨工业大学,2010.

[27]臧盛. 糜子壳多酚类物质抗氧化活性研究[D]. 杨凌:西北农林科技大学,2016.

[28]蒙琦. 红松松塔多糖分离纯化及生物活性研究[D]. 哈尔滨:哈尔滨工业大学,2010.

[29]臧延青,葛德鹏. 葵花籽壳水溶性膳食纤维的提取工艺优化及抗氧化活性[J].食品工业科技,2015,36(10):307-329.

[30]郑菲. 橡实壳多酚分离纯化、抗氧化及抑菌的研究[D]. 长沙:中南林业科技大学,2011.

[31]郝慧娟. 核桃壳提取物的成分分析及其抗氧化活性研究[D]. 太原:山西农业大学,2013.

[32]蒋其忠. 茶籽壳原花青素的分离纯化、稳定性及抗氧化活性研究[D]. 合肥:安徽农业大学,2010.

[33]Ou B,Hung D,Hampsch-Woodill M,et al. Analysis of antioxidant activities of common vegetables employing oxygen radical absorbance capacity(ORAC)and ferric reducing antioxidant power(FRAP)assays:a comparative study[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2002,50:3122-3128.

[34]周德龙,高建华,麦振龙,等. 莲子壳营养成分分析及类黄酮抗氧化活性研究[J].安徽农业科学,2011,39(7):3968-3870.

[35]刘晓丽,吴克刚,柴向华,等. 花生壳多酚对食用油抗氧化作用的研究[J].中国食品添加剂,2015,23(2):99-102.

Research progress of antioxidant function evaluationinvitroof bioactive substances in nuts shell

XU Ying-ying,ZHANG Yu,XIAO Kang-man,FAN Ze-kun,LI De-hai*

(College of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China)

Nuts shells as by-product of nuts are rich and contain amount of polyphenol,polysaccharide and flvonaoids. So it has important value to exploitation. Researches showed that the extraction of nuts shells has significant antioxidant function in free radical scavenging and anti-aging. They are high-qulity resources to be exploited for natural antioxidant. The aim of this paper is to discuss the important of evaluation method on the antioxidant function,the principle as well as usage in nuts shell,which will provide reference to exploitation and application of antioxidant in nuts shell.

nuts shell;the bioactive substance;antioxidant function;antioxidant evaluationinvitro

2016-01-25

许莹莹(1994-)，女，大学本科，研究方向：食品化学及植物有效成分，E-mail:1125470532@qq.com。

李德海(1976-)，男，副教授，研究方向：食品化学及植物有效成分，E-mail:lidehaineau@163.com。

东北林业大学大学生国家级创新实验项目(201510225070)；黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12543015)。

TS255.6

A

1002-0306(2016)14-0385-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.068