响应面法优化微波辅助提取蛇六谷生物碱工艺

陈文韬,林月珠,牛日华,项雷文

(福建师范大学福清分校,海洋与生化工程学院,福建福清 350300)



响应面法优化微波辅助提取蛇六谷生物碱工艺

陈文韬,林月珠,牛日华,项雷文*

(福建师范大学福清分校,海洋与生化工程学院,福建福清 350300)

采用微波辅助提取法从蛇六谷中提取生物碱,并用酸性染料比色法进行定量分析,用红外光谱对提取的生物碱进行定性分析。在单因素(乙醇浓度、料液比、提取温度和时间)实验的基础上,选取料液比、微波提取温度和提取时间三个因素进行响应面分析,从而对蛇六谷生物碱提取工艺进行优化。结果表明,经优化后的蛇六谷生物碱最佳提取工艺为:以95%的乙醇为提取剂,料液比为1∶20.4(g/mL),在微波消解仪中提取时间为8 min,提取温度为60 ℃,此条件下蛇六谷生物碱得率为0.216%。

蛇六谷,生物碱,响应面法,微波辅助提取,红外光谱

蛇六谷是天南星科魔芋属(Amorphophallus)多年生草本植物的干燥块茎,是江浙一带的特色中药材,尚未收入国家药典[1]。蛇六谷块茎中的成分以葡甘聚糖为主,此外还含有淀粉、生物碱、纤维素和矿物质等[2-3]。蛇六谷对人体消化道疾病、心血管疾病、糖尿病和肥胖症等均具有一定的疗效,并有防瘤抑癌的功效[4-5]。蛇六谷中含有20余种生物碱,是主要的活性成分之一,但目前对其药学性及其作用机理尚不清楚[6-7]。

蛇六谷作为中药,在煎煮过程中生物碱等物质会被浸提出来。因此,煎煮法在蛇六谷生物碱提取方法中应用最广。煎煮法操作简单,但提取过程中会造成易挥发和不稳定的生物碱的损失,如要进行工业化生产,煎煮法效率较低,同时难以进行质量控制。因此对蛇六谷生物碱高效提取方法的研究尤为重要。朱燕采用醇浸渍法多次提取,生物碱得率为0.496%[8];龙德清等采用酸性醇回流法、浸渍法提取生物碱,生物碱得率为0.47%[9-10];杨海涛等以微波法提取,并用正交实验优化提取工艺,生物碱得率为0.428%[11];杨晓帆等以索氏提取,并用正交实验优化提取工艺,生物碱得率为0.094%[12];孙天玮等以酸性醇浸渍法提取,生物碱得率为0.09%[13];张志健等以酸性醇浸渍法提取,生物碱得率为0.1%[14];张忠良等分析结果表明,生物碱为0.134%[15]。文献中生物碱得率从0.09%至0.5%不等,这是由于提取方法不同、所选取的研究对象(蛇六谷的不同部位,加工方式)不同所致。蛇六谷中总生物碱含量测定有比色法和重量法两种,其检测结果存在较大差异,这是由于重量法得到的产物中含有较多的杂质,准确性较酸性染料比色法要低。

本文采用酸性染料比色法测定总生物碱。在料液比、乙醇浓度、时间和温度4个因素设计单因素实验基础上,用响应曲面法寻求优化微波辅助提取蛇六谷生物碱的最佳提取工艺,以期为蛇六谷生物碱提取提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

蛇六谷片购于亳州药材市场;盐酸金刚烷胺(标准品)中国药品生物制品检验所;邻苯二甲酸氢钾(AR)中国测试技术研究院;溴甲酚绿西亚试剂;三氯甲烷(AR)南京利胜化学试剂有限公司;碳酸钠(AR)、氢氧化钠(AR)、95%乙醇(AR)西陇化工股份有限公司。

UV754N紫外可见分光光度计上海佑科仪器仪表有限公司;雷磁PHS-3型pH计上海仪电科学仪器科学股份有限公司;FW100型高速万能粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司;电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司;WX4000N型温压双控微波消解仪奥普勒仪器有限公司;TDL-4型低速离心机上海安亭科学仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1原料预处理将蛇六谷片用万能粉碎机粉碎,过100目筛,置于密封袋中,备用。

1.2.2蛇六谷生物碱测定

1.2.2.1标准储备液配制准确称取5 mg盐酸金刚烷胺,用三氯甲烷溶解并定容至100 mL,得50 μg/mL标准储备液。

1.2.2.2检测波长的确定用50 μg/mL盐酸金刚烷胺标准储备液进行全波长(190～1100 nm)扫描,得出最适检测波长。

1.2.2.3标准曲线的绘制盐酸金刚烷胺标准储备液用三氯甲烷稀释得到0、2、4、6、8、10 μg/mL的待测溶液。分别加入5 mL pH4.5的邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液、2 mL 0.04%溴甲酚绿溶液,摇匀,静置30 min,取三氯甲烷层于最适检测波长处测吸光度值。以盐酸金刚烷胺标液浓度为横坐标,以其相对应的吸光值为纵坐标,绘制标准曲线[11]。

1.2.2.4微波辅助法提取蛇六谷生物碱准确称取一定量的蛇六谷粉末,按一定的料液比加入不同浓度的乙醇溶液,混合均匀;在一定的温度和功率条件下微波提取一定的时间,而后以3000 r/min离心10 min,取全部上清液;用10%碳酸钠溶液调节上清液pH至10,再次以3000 r/min离心10 min,取上清液,用三氯甲烷定容至6 mL;加入2.5 mL邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠缓冲液,1 mL溴甲酚绿,摇匀,静置30 min分层后取三氯甲烷层,将其稀释至合适浓度,静置15 min后在最适检测波长处测吸光度。

根据公式(1)计算生物碱的含量：

式(1)

式中:A-吸光度;V-生物碱提取液调pH10离心后的上清液体积,mL;B-稀释倍数;m-蛇六谷的质量,g。

1.2.3单因素实验

1.2.3.1乙醇浓度对蛇六谷生物碱得率的影响准确称取0.60 g蛇六谷粉末,按料液比1∶5(g/mL)分别加入65%、75%、85%、95%乙醇溶液和无水乙醇,在70 ℃下微波消解8 min,功率为30%,压力为1.5 MPa条件下提取,按1.2.2.4步骤操作,测吸光度并计算得率。

1.2.3.2料液比对蛇六谷生物碱得率的影响分别准确称取0.60、0.30、0.20、0.15、0.12 g蛇六谷粉末,按料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(g/mL)加入95%的乙醇,在微波70 ℃,功率30%,1.5 MPa压力条件下提取8 min,按1.2.2.4步骤操作,测吸光度并计算得率。

1.2.3.3提取温度对蛇六谷生物碱得率的影响准确称取0.15 g蛇六谷粉末,按料液比1∶20(g/mL)加入95%的乙醇溶液,分别在40、50、60、70、80 ℃下微波消解,功率为30%,1.5 MPa压力条件下提取8 min,按1.2.2.4步骤操作,测吸光度并计算提取率。

1.2.3.4提取时间对蛇六谷生物碱得率的影响准确称取0.15 g蛇六谷粉末,按料液比1∶20(g/mL)加入95%的乙醇溶液在60 ℃下微波消解,功率为30%,1.5 MPa压强条件下分别提取4、8、12、16、20 min,按1.2.2.4步骤操作,测吸光度并计算得率。

1.2.4响应曲面法实验设计在单因素实验的基础上,根据Design-Expert 8.0.5 b软件中Box-Behnken原理,选取料液比、微波提取温度和提取时间3个因素用响应面优化蛇六谷生物碱提取实验,每个因素设低、中、高3水平,分别用代码-1、0、+1表示,实验因素与水平设计见表1。

表1　蛇六谷生物碱提取Box-Behnken实验因素及水平Table 1　Factors and levels of Box-Behnken expetiments for the extraction of Konjac alkaloids

1.2.5红外光谱定性分析按优化后的工艺提取得到生物碱提取物,先将三氯甲烷蒸发得到棕色浓稠状固体,再将该稠状物置于恒温箱70 ℃干燥24 h,最后呈棕褐色膏状固体,在红外光谱仪中扫描得到其图谱,与标准图谱相比较进行定性分析。

1.3数据处理

数据使用Design-Expert 8.0.5b软件分析。

2　结果与分析

2.1标准曲线制作

对盐酸金刚烷胺标准溶液进行全波长(190～1100 nm)扫描,其图谱如图1所示。

由图1可知,盐酸金刚烷胺溶液在可见波长(1100～550)nm区域无吸收,从550 nm才有吸收,在414 nm吸收达到最高,而后随着波长变短,吸光度下降。因此,盐酸金刚烷胺最大吸光波长为414 nm,以此为检测波长。

图1　盐酸金刚烷胺紫外光谱图Fig.1　UV spectrum of amantadine hydrochloride

以盐酸金刚烷胺标准样品浓度(X)与所得吸光度(Y)作图,标准曲线回归方程为Y=0.0667X-0.0135,r=0.9953,这表明盐酸金刚烷胺标准物质在2～10 μg/mL范围内线性关系良好。

2.2单因素对蛇六谷生物碱得率的影响

2.2.1乙醇浓度对蛇六谷生物碱得率的影响乙醇浓度对蛇六谷生物碱得率的影响如图2所示。

图2　乙醇浓度对蛇六谷生物碱得率的影响Fig.2　Effect of ethanol concentration on the extraction rate of alkaloids from Konjac

由图2可知,在微波辅助提取过程中,随着乙醇浓度增加,生物碱得率也相应增加。当乙醇浓度达到85%后,曲线趋于平缓,说明乙醇溶度在85%以上时得率变化较小,考虑到提取成本,因此选择95%乙醇作为蛇六谷生物碱的提取溶剂。

2.2.2料液比对蛇六谷生物碱得率的影响在微波提取过程中,蛇六谷质量与提取溶剂的比例(料液比)是重要影响因素,料液比对蛇六谷生物碱得率的影响如图3所示。

图3　料液比对蛇六谷生物碱得率的影响Fig.3　Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of alkaloids from Konjac

由图3可知,随着料液比的增大,生物碱得率也随之增加,当料液比达到1∶20(g/mL)时,再增加料液比,生物碱的得率反而下降。这可能是因为随着料液比的增加,杂质的溶出也增加,抑制生物碱的提取或影响了生物碱的测定,同时在生产中会消耗更多的溶剂和能量。因此确定最佳料液比为1∶20(g/mL)。

2.2.3提取温度对蛇六谷生物碱得率的影响提取温度对蛇六谷生物碱得率的影响如图4所示。

图4　微波提取温度对蛇六谷生物碱得率的影响Fig.4　Effect of microwave temperature on the extraction rate alkaloids from Konjac

由图4可知,随着微波温度的增加,生物碱得率呈上升趋势,当温度达到60 ℃时,生物碱得率最高,之后随温度升高反而降低,这可能是温度升高导致生物碱结构不稳定,发生了分解。另外温度太高,乙醇挥发较为严重,也影响了生物碱的提取。因此最佳提取温度为60 ℃。

2.2.4提取时间对蛇六谷生物碱得率的影响提取时间对蛇六谷生物碱得率的影响如图5所示。

图5　微波浸提时间对蛇六谷生物碱得率的影响Fig.5　Effect of microwave time on the extraction rate of alkaloids from Konjac

由图5可知,微波恒温时间在8 min内,蛇六谷生物碱得率随时间延长而上升;当微波时间为8 min时,生物碱得率最高;此后,随着提取时间的延长得率并未增加反而下降。这可能是微波对生物碱有消解作用,故取8 min为微波浸提生物碱最佳时间。

2.3响应曲面法优化实验

Box-Behnken的3因素3水平实验共17个实验点。其中,12个是析因点,自变量取值在A、B、C所构成的三维顶点;5个是零点,为区域的中心点,用来估计实验误差,蛇六谷生物碱得率见表2。采用Design-Expert 8.0.5b软件对表2实验数据进行回归分析及多元回归拟合,实验方差分析如表3所示。

表3　蛇六谷生物碱提取Box-Behnken实验方差分析Table 3　Analysis of variance of Box-Behnken experiment for the extraction of alkaloids from Konjac

注:*表示模型或考察因素有显著影响(p<0.05);**表示模型或考察因素有极显著影响(p<0.01)。

响应面分析实验各因素之间的响应曲面图如图6～图8所示。

表2　蛇六谷生物碱提取Box-Behnken实验结果Table 2　Design and results of Box-Behnken experiment for the extraction of alkaloids from Konjac

图6　料液比、提取温度交互作用 对蛇六谷生物碱得率的响应面图Fig.6　Response surface of the effects of solid-liquid ratio and microwave temperature on the extraction rate of alkaloids from Konjac

图7　料液比、提取时间交互作用 对蛇六谷生物碱得率的响应面图Fig.7　Response surface of the effects of solid-liquid ratio and microwave time on the extraction rate of alkaloids from Konjac

图8　提取温度、提取时间交互作用 对蛇六谷生物碱得率的响应面图Fig.8　Response surface of the effects of microwave temperature and microwave time on the extraction rate of alkaloids from Konjac

从图6可以看出,在提取时间8 min时,提取温度和料液比两个因素交互作用显示,在提取温度57～63 ℃,料液比1∶18～1∶22的范围内蛇六谷生物碱得率可达实验最佳值。由图7响应曲面的弯曲程度可知,料液比与提取时间的交互作用对蛇六谷生物碱得率影响显著,表现为曲面较陡呈钟罩型。在提取温度为60 ℃时,提取时间和料液比两个因素交互作用显示,在提取时间7～9 min,料液比为1∶18～1∶22的范围内蛇六谷生物碱得率可达实验最佳值。从图8可以看出,在料液比为1∶20时,提取时间和温度两个因素交互作用显示,在提取时间7.5～9 min,提取温度58～62 ℃的范围内蛇六谷生物碱得率可达实验最佳值。由于微波浸提时间和温度的交互作用对蛇六谷生物碱得率影响不显著,在图8响应面上表现为曲面较为平缓。

响应面值最大时,X1、X2、X3对应的编码值分别为0.076、0.001、0.068,与之对应的蛇六谷生物碱微波辅助提取的最佳工艺条件为:料液比1∶20.38(g/mL),恒温温度60.01 ℃,微波时间8.14 min。此时,蛇六谷生物碱的理论得率为0.218%。

为检验响应面的可靠性,采用最佳提取工艺条件对蛇六谷生物碱提取进行实验验证,同时考虑到实际操作的便利性,将工艺参数修正为料液比1∶20.4(g/mL),恒温温度60 ℃,微波时间8 min。在此条件下做3次平行实验测得蛇六谷生物碱得率为0.216%±0.006%,与理论预测值0.218%基本吻合,说明采用响应面法优化得到的提取条件准确可靠,具有实用价值。

2.4蛇六谷生物碱红外光谱分析

蛇六谷提取物浓缩后得到的棕褐色膏状物在红外光谱仪中扫描得到其图谱,如图9所示。

图9　生物碱红外光谱图Fig.9　The IR spectra of alkaloid from Konjac

图9与文献[16]对比可知,3438.38 cm-1出峰,可知样品含活性氢,如-NH2、-NH、-OH等,而2923.7、2854.82 cm-1及1384.708 cm-1峰为-CH3、-CH2-,1729.92 cm-1峰则为C=C、C=N或C=O,1639.28 cm-1峰可能是C=C,图9中各个峰值相似,为生物碱类化合物。

3　结论

以盐酸金刚烷胺标样,采用酸性染料比色法对从蛇六谷中提取的生物碱进行测定。通过紫外可见波长扫描,确定盐酸金刚烷胺标样的最大吸收波长为414 nm,并选择此波长作为检测波长。在单因素实验的基础上,根据Box-Behnken原理设计实验,通过响应面分析,得到最佳微波提取条件为:乙醇浓度95%,料液比1∶20.4(g/mL),恒温温度60 ℃,微波时间8 min。在此条件下做验证实验,得到蛇六谷生物碱得率为0.216%,与理论预测值0.218%较为吻合,说明建立的响应模型稳定可靠,适用于蛇六谷生物碱提取工艺的优化。并由红外光谱确认蛇六谷提取物为生物碱。

[1]韩海成,陈培丰.中药蛇六谷相关中药品种抗癌作用研究进展[J].云南中医中药杂志,2007,28(7):51-53.

[2]冲增哲.魔芋科学[M].成都:四川大学出版社,1990:142.

[3]Nishinari K.Konjac glucomannan[J].Developments in Food Science,2004,42(4):309-330.

[4]张展,文健,龚晓艳,等.魔芋精粉中葡甘聚糖含量检测与分析[J].武汉大学学报:理学版,2001,47(2):150-152.

[5]Chen H L,Cheng H C,Wu W T,et al.Supplementation of konjac glucomannan into a low fiber chinese diet promoted bowel movement and improved colonic ecology in constipated adults:a placebo-controlled,diet-controlled trial[J].J Am Coll Nutr,2008,27(1):102-108.

[6]庞杰,刘文娟,陈明木,等.魔芋生物碱的纯化与结构表征[J].福州大学学报:自然科学版,2002,30(增刊):737-739.

[7]潘磊,陈培丰,吴巧凤,等.中药蛇六谷提取物对人肝癌-和大鼠胶质瘤细胞增殖的影响[J].中华中医药学刊,2010,28(8):1625-1629.

[8]朱燕.魔芋生物碱提取方法[J].贵阳学院学报：自然科学

版,2010,5(1):42-43.

[9]龙德清,丁宗庆,谢茂军.酸性醇回流法提取魔芋中的总生物碱研究[J].食品科学,2003,24(7):87-89.

[10]龙德清,饶贞学,丁宗庆.酸性醇浸渍法提取魔芋中的总生物碱[J].食品科学,2003,24(10):126-127.

[11]杨海涛,刘军海.微波法提取魔芋中总生物碱工艺的研究[J].安徽农业科学,2008,36(3):847-847.

[12]杨晓帆,王红,王芳,等.魔芋总生物碱量的测定[J].光谱实验室,2011,28(1):153-156.

[13]孙天玮,徐婷,周海燕,等.魔芋飞粉总生物碱的提取工艺研究[J].现代生物学进展,2008,8(12):2278-2281.

[14]张志健,梁引库.魔芋加工下脚料中总生物碱提取技术研究[J].中国食品添加剂,2011,26(1):100-104.

[15]张忠良,王照利,吴万兴.魔芋中总生物碱提取实验初报[J].食品工业科技,2004,25(9):94-95.

[16]庞杰,刘文娟,陈明木,等.魔芋生物碱的纯化与结构表征[J].福州大学学报：自然科学版,2002,30(增刊):737-739,754.

Optimization of microwave-assisted extraction for Konjac alkaloids by response surface methodology

CHEN Wen-tao,LIN Yue-zhu,NIU Ri-hua,XIANG Lei-wen*

(School of Ocean Science and Biochemistry Engineering,Fuqing Branch of Fujian Normal University,Fuqing 350300,China)

The microwave-assisted extraction,infrared spectrum qualitative analysis and the acid dye colorimetry for quantitative analysis were carried out on the alkaloids from Konjac. Based on the single-factor(ethanol concentration,solid-liquid ratio,microwave time and temperature)tests,taken the solid-liquid ratio,extract temperature and extract time as independent variables and the content of the alkaloids from Konjac as dependent variable,the extract parameters of the alkaloids from Konjac were optimized by response surface methodology. The results showed that the optimized extract parameters were 95% ethanol as extraction solvent,solid-liquid ratio was 1∶20.4(g/mL),extract time was 8 min,extract temperature was 60 ℃. Under the optimized extract conditions,the extraction rate of alkaloid reached 0.216%.

Konjac;alkaloid;response surface methodology;microwave-assisted extraction;infrared spectrum

2015-12-22

陈文韬(1969-),男,博士,教授级高工,主要从事天然产物综合利用、多组分高分子材料加工等方面的研究,E-mail:cwt282@163.com。

项雷文(1975-),男,博士,副教授,主要从事天然产物综合利用、生物大分子分离与表征、食品中美拉德反应等方面的研究,E-mail:xiangleiwen@163.com。

福建省教育厅、福建省科技厅项目(JK2010064);福建省省级重点学科“食品科学与工程”建设项目(闽教高[2012]48号)。

TS255.36

B

1002-0306(2016)14-0257-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.043