无痕敲除法构建食品安全级枯草芽孢杆菌无芽孢菌株

张明俐,柳鹏福,史吉平,曾　勇

(1.烟台大学生命科学学院,山东烟台 264005;2.中国科学院上海高等研究院,绿色化学工程技术中心,上海 201210)



无痕敲除法构建食品安全级枯草芽孢杆菌无芽孢菌株

张明俐1,2,柳鹏福2,史吉平2,曾勇1,*

(1.烟台大学生命科学学院,山东烟台 264005;2.中国科学院上海高等研究院,绿色化学工程技术中心,上海 201210)

利用同源重组法快速构建枯草芽孢杆菌(Bacilussubtilis168)spo0A基因缺陷型无芽孢菌株B.subtilis168Δspo0A。经PCR及核酸电泳验证,孢子形成率鉴定和芽孢染色镜检,确定最终获得不产芽孢的B.subtilis168Δspo0A基因缺失突变菌株。基因敲除完成后,菌株基因组不需引入抗性基因或其它任何筛选标记,实现了对spo0A基因的无痕基因敲除。本研究对枯草杆菌的工业化生产及提高相关产品食品质量安全性具有重要意义。

枯草芽孢杆菌(Bacilussubtilis168),无痕基因敲除,无芽孢菌株

近年来,随着分子生物学和基因工程技术的发展,枯草芽孢杆菌作为基因工程表达系统发展迅速。2011年Wang等[1]通过对枯草芽孢杆菌的代谢途径的改造进行了维生素B2的生产;2013年Phan等[2]通过构建枯草芽孢杆菌基因工程菌使得异源蛋白在枯草芽孢杆菌内大量表达;此外,还有很多应用枯草芽孢杆菌进行核糖生产[3]的报道。

枯草芽孢杆菌的胞外蛋白分泌能力强、生长速率快,发酵周期短以及其公认安全(Generally Recognized as Safe,GRAS)特性[4]使其成为微生物发酵工业化生产研究热点。在营养缺乏的条件下,枯草芽孢杆菌会停止生长,产生抗逆性很强的内源性孢子——芽孢。生成芽孢的枯草芽孢杆菌休眠体,对外源基因表达能力大大降低,使枯草芽孢杆菌的工业生产应用受到很大限制[5]。芽孢形成过程的初始阶段是由spo0A基因参与调控spo0B,spo0E,spo0F等多个基因的共同表达而启动的[6]。1998年,Rowe-Magnus等[7]详细阐述了spo0A基因在芽孢形成过程的作用机制。2004年,余志强等[8]通过同源重组法成功获得了枯草杆菌spo0A基因缺失突变菌株。但该方法的敲除过程中引入了多余的抗性基因,限制了其在食品工业中的应用。

本研究利用革兰氏阳性菌的穿梭质粒pMAD[9]构建了spo0A基因敲除载体pMAD-Δspo0A,诱导敲除元件Δspo0A与宿主基因组发生两次同源重组并取代B.subtilis168基因组上完整的spo0A基因实现了对枯草芽孢杆菌spo0A基因的无痕敲除,并通过分子生物学手段和功能验证,证实该基因的缺失阻断了芽孢的形成,达到了预期目的。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

菌株和质粒枯草芽孢杆菌168菌株(B.subtilis168),用于同源重组的出发菌株,购自美国模式菌种收集中心(ATCC 23857);大肠杆菌DH5α(E.coliDH5α),用做DNA片段克隆与富集,为实验室保存菌株;pMAD质粒,为革兰氏阳性菌基因敲除载体,由法国Michel De’barbouille教授惠赠[9];限制性内切酶、T4 DNA连接酶TAKARA公司;KOD PCR Mix及BufferTOYOBO公司;PCR引物合成苏州金维智公司;枯草杆菌基因组DNA抽提、质粒抽提、DNA片段纯化试剂盒Axygen公司。

S1000 PCR仪、MicroPulser电穿孔仪、0.2 cm电转杯、Gel Dox XR+凝胶成像系统美国BIO-RAD;EPS-300电泳仪、HE-90核酸电泳槽上海天能;ZDP-A2160A电热培养箱、ZHWY-2110B摇床上海智城分析仪器制造有限公司。

1.2培养基

LB培养基用于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的培养。

电转化枯草芽孢杆菌培养基配方:LB培养基,山梨醇0.5 mol/L。

RM培养基(用于菌种复苏)配方:LB培养基,山梨醇0.5 mol/L,甘露醇0.38 mol/L。

枯草杆菌芽孢诱导培养基配方按甄静[10]的方法配制。

根据需要在培养基中添加抗生素或X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷),配制时过滤除菌。其中氨苄青霉素(Amp)工作浓度为100 μg/mL,红霉素(erm)工作浓度为10 μg/mL,用乙醇溶解配制,X-gal工作浓度为50 μg/mL,用二甲基酰胺溶解配制。

1.3实验方法

1.3.1PCR引物的设计上游同源臂spo0A-up扩增引物a1/s1,下游同源臂spo0A-down扩增引物a2/s2,单交换鉴定引物a3/s4和a4/s3,扩增敲除片段Δspo0A的overlap PCR[11]及双交换完成鉴定引物a1/s2(引物序列见表1/引物位置见图1)。

表1　PCR扩增片段引物信息Table 1　Information of PCR amplification segments’ primer

1.3.2PCR方法同源臂片段及基因敲除验证的PCR扩增体系为:2×KOD Mix 25 μL,上下游引物各1 μL,DNA 1 μL,H2O 22 μL。PCR条件为:预变性94 ℃、5 min,变性94 ℃、30 s,退火52 ℃、30 s,延伸68 ℃、1 min/kb。25个循环。68 ℃延伸10 min,终止。

两段同源臂片段连接成Δspo0A敲除元件采用重叠延伸PCR(overlap PCR)法拼接到一起,反应体系为:2×KOD Mix 25 μL,上下游引物(a1/s2)各1 μL,上下游同源臂片段DNA各5 μL,H2O 13 μL。PCR条件为:预变性94 ℃、5 min,变性94 ℃、30 s,退火 50 ℃、50 s,延伸68 ℃、3 min,25个循环。68 ℃延伸10 min,结束。

1.3.3敲除载体pMAD-Δspo0A的构建将上述PCR扩增获得的spo0A基因上下游同源臂的DNA片段用BamHI和EcoRI双酶切,片段清洁回收后与同样经过BamHI和EcoRI双酶切的质粒pMAD连接,转化到大肠杆菌DH5α进行扩增,得到的重组质粒即为可用于后续基因敲除的载体pMAD-Δspo0A。

1.3.4spo0A基因敲除的操作步骤将敲除载体质粒pMAD-Δspo0A电转化进枯草芽孢杆菌168菌株,涂布X-gal加红霉素抗性平板,30 ℃过夜培养。挑取显蓝色转化子,液体LB培养基中30 ℃过夜培养,按5%接种量转接至5 mL红霉素抗性的LB培养基,30 ℃孵育2 h,升温至42 ℃继续孵育6 h,稀释(10-2～10-5)涂布含有X-gal和红霉素的平板,42 ℃过夜培养。用a3/s4和a4/s3菌落PCR验证,每个菌都做两个PCR,扩增时间2 min,电泳选择能扩出来条带的即为单交换完成的阳性克隆。挑取阳性单菌落于30 ℃和无抗性LB培养基中孵育6 h,升温至42 ℃继续孵育3 h,稀释(10-2～10-5)涂布含有X-gal的无抗性LB平板,42 ℃过夜培养。挑取显白斑的单菌落做菌落PCR鉴定,引物用a1/s2,扩增时间3 min,电泳检测片段大小应为2.4 kb的为阳性克隆。

1.3.5spo0A基因缺陷型菌株的鉴定方法按照Agaisse H等[12]的方法分别对野生型枯草芽孢杆菌与spo0A基因缺陷型菌株进行芽孢形成率检测和菌体及芽孢染色,鉴定spo0A基因的敲除是否成功阻断了菌株芽孢的形成。

1.3.6菌种生长曲线的测定将-80 ℃冰箱冻存的菌种接入LB培养基中37 ℃摇床活化培养12 h,将活化后的菌种以1%的量转接至含有50 mL LB培养基的250 mL摇瓶中,37 ℃,200 r/min恒温摇床培养,培养时间72 h。每隔8 h取样,测定吸光值的变化。设置3组平行实验,采用偏差不大于15%的数据作为有效数据。以培养时间作为横坐标,相应的吸光值为纵坐标绘制菌种生长曲线。

2　结果与讨论

2.1spo0A基因敲除的原理

敲除载体的构建及同源重组发生过程如图1所示:①,②,③片段分别表示spo0A基因上游1200 bp片段,spo0A基因编码序列(804 bp),spo0A基因下游1201 bp片段。

(A)以野生型菌株基因组为模板,设计引物a1/s1,a2/s2,PCR分别扩增spo0A基因上下游同源臂。连接两段同源臂构建成敲除元件Δspo0A。(B)敲除元件插入pMAD质粒构建成完整敲除载体pMAD-Δspo0A。(C)敲除载体进入细菌后,42 ℃温度诱导下,首先与基因组发生单交换,敲除载体pMAD-Δspo0A可由两个位点插入B.subtilis168基因组。一次同源重组发生后pMAD-Δspo0A质粒从不同位置整合入菌株基因组,此时菌株携带质粒红霉素抗性,设计引物a3/s4,a4/s3验证单交换的发生,引物一端位于插入基因组的pMAD质粒序列内部,一端位于原始基因组序列上,长度约为1750 bp。(D)选择发生单次交换的菌株继续培养,插入片段发生二次同源重组,B.subtilis168菌株基因组上的pMAD-spo0A片段脱落丢失,形成B.subtilis168Δspo0A菌株。

图1　重组质粒pMAD-Δspo0A的构建与spo0A基因敲除原理Fig.1　Principle of recombinant plasmid pMAD-Δspo0A construction and spo0A gene knockout

2.2敲除片段的克隆与鉴定

按1.3方法所示的PCR条件与引物在spo0A基因的上下游分别PCR扩增获得长度为1200 bp左右的同源片段spo0A-up,spo0A-down(图2)。同源片段清洁回收备用。

图2　spo0A上下游同源臂的扩增Fig.2　Amplification of spo0A upstream and downstream homologous arm segments 注：1、2：spo0A-up片段； 3、4：spo0A-down片段； 5：Marker。

Overlap PCR拼接同源片段spo0A-up,spo0A-down,PCR条件按1.3所示overlap PCR条件。获得长度约为2400 bp的Δspo0A长片段(图3)。

图3　spo0A敲除元件PCR拼接Fig.3　spo0A knockout module PCR link 注：1:Marker；2、3：敲除元件Δspo0A。

2.3敲除载体的构建与鉴定

分别用限制性内切酶BamHI,EcoRI在37 ℃条件下酶切温敏型穿梭质粒pMAD约3 h,获取携带两个酶切位点的线性pMAD质粒,清洁回收该质粒备用。用T4 DNA ligase 16 ℃连接敲除片段Δspo0A与pMAD,获取完整的敲除载体pMAD-Δspo0A。

2.4spo0A基因敲除

电穿孔转化法将敲除载体pMAD-Δspo0A导入到菌株B.subtilis168中,30 ℃过夜培养,红霉素(erm)抗性平板生长的单菌落即为转入了整合载体的转化子。

挑取转化子继续培养,由于敲除载体存在spo0A基因上下游序列同源序列,可以通过单交换整合于基因组spo0A的上游或下游上,提高培养温度到42 ℃继续培养6 h,温敏型敲除载体丢失,涂布红霉素抗性和X-gal的平板,能够生长的蓝色菌落为发生了单次交换的突变体。用两对鉴定引物a3/s4,a4/s3同时对一个单菌落进行PCR验证单交换的发生,其中一对引物能够扩增出约1750 bp条带,另一对引物不能扩增出条带的为阳性克隆(图4)。一次重组的突变体在30 ℃无抗生素压力的条件下继续培养,无抗环境进一步诱导发生第二次同源重组,继续在42 ℃培养过夜,质粒序列脱离菌株基因组丢失。经过两次同源重组,敲除片段Δspo0A交换到枯草芽孢杆菌基因组上替换spo0A基因序列,或者发生回复突变。鉴定引物a1/s2 PCR验证双交换的完成,扩增出2400 bp条带的克隆为spo0A基因敲除成功的菌株,扩增出3200 bp条带的克隆为发生回复突变的菌株(图5)。

图4　单交换PCR验证Fig.4　Single crossover validation 注：1、5、6：分别在两个重组位点发生单交换1750 bp； 2、3、4：分别在两个重组位点未发生单交换；7：Marker。

图5　spo0A基因敲除成功验证Fig.5　spo0A knockout over validation 注：1：Marker； 2、3、4：Δspo0A 2400 bp； 5、6、7 ：B.subtilis168未敲spo0A基因3200 bp。

随着质粒丢失,突变菌株失去红霉素抗性,在X-gal和无抗LB平板上为白斑菌落。实验发现平板上白斑菌落有两种表观差异明显的菌落,两种菌落都具有枯草杆菌基本形态特征:白色,表面粗糙不平滑,边缘波状。两种菌分别经PCR验证后发现:菌落形态比较规则,透光性差的菌落为野生型菌落(图6);形状比较不规则,更加透明的菌落为基因敲除成功克隆(图7)。

图6　野生型B. subtilis168在LB平板上的菌落形态Fig.6　The colony characteristics of wild-type B. subtilis168 on LB plating medium

图7　突变型B. subtilis168Δspo0A在LB平板上的菌落形态Fig.7　The colony characteristics of B. subtilis168Δspo0A on LB plating medium

2.5B.subtilis168Δspo0A与B.subtilis168芽孢形成及生长周期比对

2.5.1野生型B.subtilis168与B.subtilis168Δspo0A孢子形成率按照1.3.5所述芽孢率形成鉴定方法,在80 ℃下加热10 min基本能够完全杀死枯草芽孢杆菌营养细胞,而芽孢具有强抗逆性,活力基本不会受到影响。

分别将野生型枯草芽孢杆菌菌株和spo0A缺陷型菌株设置三组平行,使用枯草芽孢杆菌芽孢形成培养基摇床培养24 h后,取样梯度稀释,分别取10-6、10-7、10-8三个梯度各100 μL,涂平板,测定菌种浓度;同时将这三组剩余菌液置于80 ℃水浴锅加热15 min,杀死营养细胞,涂平板,测定芽孢形成率。37 ℃倒置培养24 h后计算两组菌种芽孢形成率。

从表2数据可以看出,野生型菌株诱导培养24 h后形成芽孢。敲除spo0A基因可以完全阻断枯草芽孢杆菌芽孢的形成。

表2　野生型B.subtilis 168与B.subtilis168 Δspo0A菌株芽孢形成率测定Table 2　Sporulation ratio of wild type B.subtilisand 168Δspo0A strains bacillus

2.5.2野生型B.subtilis168与B.subtilis168Δspo0A芽孢染色镜检分别将野生型枯草杆菌与spo0A基因缺陷型菌株(B.subtilis168Δspo0A)接入枯草杆菌芽孢形成培养基中37 ℃培养24 h,进行革兰氏染色,孔雀绿染液加热染色5 min,番红复染1 min后镜检,经革兰氏染色后芽孢呈现初染液孔雀绿的绿色,营养细胞呈现番红复染液的红色(图8、图9)。对比可以看出相同条件下培养24 h后,B.subtilis168Δspo0A视野内没有芽孢生成,而野生型B.subtilis168生成大量芽孢休眠体。

图8　B.subtilis168Δspo0A用芽孢形成 培养基培养24 h染色结果(1000×)Fig.8　Stain and microscopic examination result of B.subtilis168 Δspo0A cultured in sporulation medium for 24 h(1000×)

图9　 野生型B.subtilis168用芽孢 形成培养基24 h染色结果(1000×)Fig.9　Stain and microscopic examination result of Wild type B.subtilis168 cultured in sporulation medium for 24 h(1000×)

2.5.3野生型B.subtilis168与B.subtilis168Δspo0A生长曲线野生型B.subtilis168与B.subtilis168Δspo0A菌种按照1.3.6所述方法进行培养并制作生长曲线(图10)。可以看出同样培养条件下,无芽孢B.subtilis168Δspo0A生长规律与野生型B.subtilis168存在明显差异。野生型B.subtilis168在培养8 h后对数期结束,生长速率减缓,在8～48 h为稳定期,48 h后到达衰亡期。而B.subtilis168Δspo0A菌株在32 h内均保持较快生长速率,最高菌种浓度远远超过野生型菌株,但菌种活力对培养条件的变化更加敏感,随着培养基的逐渐消耗,菌种在32 h后进入衰亡期。

图10　野生型B. subtilis 168与B. subtilis 168Δspo0A 在LB培养基中的生长曲线Fig.10　Growth curve of wild B. subtilis 168 and B. subtilis 168Δspo0A

3　结论

spo0A基因是控制枯草芽孢杆菌芽孢生成的基因之一,在枯草杆菌稳定期起始开始表达,其表达产物不仅调节着其它芽孢生成相关基因的表达,而且影响着枯草芽孢杆菌稳定期其他相关代谢产物基因的表达。敲除spo0A基因后的枯草芽孢杆菌菌落形态发生了很大改变,菌落变得比较透明,形状更加不规则。通过对枯草芽孢杆菌芽孢基因spo0A基因的敲除,可以消除菌种生长过程中芽孢的产生,对提高枯草芽孢杆菌工业生产效率有重要意义。

余志强等[6]曾利用同源重组整合法构建spo0A基因缺陷型枯草芽孢杆菌菌株。在该同源重组过程中对枯草芽孢杆菌基因组引入了新霉素抗性基因(neor)作为基因缺陷型菌株筛选标记。该方法获得的改造菌株含有新霉素抗性,如继续对该菌株进行基因改造则不能再用新霉素抗性基因作为筛选标记。因此这种同源重组法将对菌株的进一步改造产生局限性,并且携带抗生素抗性的菌株引入了多余的抗性基因,其产物作为食品药品添加成分会存在安全隐患。而本研究获得的spo0A基因缺陷型枯草芽孢杆菌菌株不需引入抗性基因或其他筛选标记,此类基因敲除过程称为无痕敲除,对菌种的继续改造无任何限制,并且不会引起食品药品安全隐患,是一种可以广泛应用的基因改造方法。

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Construction of a food safe gradeBacillussubtilisnonspore strain with clean deletion

ZHANG Ming-li1,2,LIU Peng-fu2,SHI Ji-ping2,ZENG Yong1,*

(1.College of Life Sciences,Yantai University,Yantai 264005,China;2.Green Chemical Engineering Technology Center,Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Pudong New District,Shanghai 201210,China)

Construction a nonsporeB.subtilis168 strain(B.subtilis168Δspo0A)by deleting thespo0Agene using the method of homologous recombination. The nonsporeB.subtilis168Δspo0Astrain was successfully got through PCR,nucleic acid electrophoresis,sporulation ratio and microscopy identification.The genome of this engineering strain does not need to insert resistance gene or any other selection marker gene afterspo0Agenes’ knockout which called clean deletion. This study is of great significance for industrial production ofB.subtilisas well as improve safety of food and drug.

Bacilussubtilis168;clean deletion;nonspore strain

2016-01-20

张明俐(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：微生物与免疫，E-mail:zml919201949@126.com。

曾勇(1967-)，男，副教授，研究方向：水生动物的病原与免疫机制，E-mail:zy110cn@aliyun.com。

TS201.3

A

1002-0306(2016)14-0175-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.027