多棘海盘车体壁脱钙工艺的研究

李　晓,王　颖,*,李红艳,吴志宏,刘天红,孙元芹,刘　伟

(1.山东省海洋生物研究院,山东青岛 266100;2.中国科学院海洋研究所,山东青岛 266071)



多棘海盘车体壁脱钙工艺的研究

李晓1,王颖1,*,李红艳1,吴志宏1,刘天红1,孙元芹1,刘伟2

(1.山东省海洋生物研究院,山东青岛 266100;2.中国科学院海洋研究所,山东青岛 266071)

多棘海盘车体壁主要由胶原纤维形成的三维立体网构成,孔洞由无机物填充,钙含量高。为提取胶原蛋白或明胶,首先要对多棘海盘车的体壁进行脱钙处理。本文主要研究盐酸对多棘海盘车体壁进行脱钙处理的工艺及脱钙前后多棘海盘车体壁的变化情况。在对脱钙工艺中的盐酸浓度、脱钙时间、料液比单因素实验的基础上,通过正交实验,优化结果表明:盐酸浓度为1.0 mol/L,脱钙时间为21 h,料液比为1∶10,体壁脱钙率可达73.85%。多棘海盘车体壁在脱钙处理后韧性增强,内部结构变得松散、粗糙。在脱钙过程中,盐酸逐渐渗透到体壁内部,无机离子从内部扩散出来。

多棘海盘车,脱钙,体壁,盐酸,内部结构

多棘海盘车(Asteriasamurensis),又名海星,属棘皮动物门(Echinodermata)海盘车纲(Asteroidea)钳棘目(Forcipulate)海盘车科(Asteriidate)[1],是我国北方海域的主要品种[2]。多棘海盘车喜食贝类,是底栖生物群落的重要捕食者,大量聚集时会对扇贝、魁蚶、牡蛎、鲍鱼等贝类养殖和底播增殖造成严重危害[3-6]。

多棘海盘车的功效首载于《东北动物药》[6]。在沿海地区,多棘海盘车黄[7](消化腺和生殖腺)常被作为食用点心或者药物[8],科研人员也相继从多棘海盘车黄内分离获得具有抗癌、抗菌、降血压等多种生理和药理活性[9]的皂甙、甾醇、多糖、生物碱类等特殊化学物质[10]。但是,目前对多棘海盘车的体壁利用研究较少。多棘海盘车体壁中的有机物主要为胶原蛋白,可提取胶原蛋白或明胶[6];无机物主要为羟基磷灰石(HAP)[Ca10(PO4)6(OH)2][11-12],由于羟基磷灰石特殊的排列方式,对提取胶原十分不利[13]。因此,在多棘海盘车的体壁利用之前,要除去其中的钙,进行脱钙处理。多棘海盘车体壁成分与鱼鳞相似,而目前对鱼鳞脱钙工艺研究较多[14-16],为多棘海盘车体壁脱钙工艺的处理提供了借鉴。鱼鳞脱钙一般采用两种方法——EDTA去钙或者酸脱钙[17],本文以多棘海盘车体壁为原料,采用盐酸作为脱钙液,研究脱钙工艺的最佳条件及体壁在脱钙前后的变化,旨在为多棘海盘车的开发利用提供基础数据及科学依据。

1　材料与方法

1. 1材料与仪器

多棘海盘车采自青岛八大峡附近海域(2014年5月);盐酸、乙二胺基四乙酸二钠(EDTA)、铬黑-T、乙二醇甲醚、三乙醇胺、氨水、氢氧化钠、硫酸铜、氯化钙、氯化铵、酒石酸钾钠均为分析纯。

表2　多棘海盘车体壁的主要组成成分(干重,%)

FA1604N型电子分析天平上海精密仪器仪表有限公司;FMN10010-RO型纯水机青岛富勒姆科科技有限公司;A200型全自动氨基酸分析仪德国安米诺西斯公司;S-3400N型扫描电子显微镜日本日立公司;IXRF systems能谱仪美国天美公司;JEE-420型真空喷镀仪日本电子株式会社。

1. 2实验方法

1.2.1前处理样品采集后,冲洗泥沙,用刀具将多棘海盘车沿腹面步带沟剖开,分离生殖腺和体壁,洗净体壁待用。

1.2.2理化成分的测定粗蛋白、粗脂肪、总糖、灰分和钙分别参照GB 5009.5-2010凯氏定氮法、GB/T 5009.6-2003酸水解法、GB/T 9695.31-2008直接滴定法、GB 5009.4-2010食品中灰分测定法和GB 5009.92-2003食品中钙测定法进行测定。羟脯氨酸按照安米诺西斯氨基酸分析仪检测方法进行。

1.2.3脱钙方法称取多棘海盘车体壁,先以0.1 mol/L的NaOH浸泡24 h,持续搅拌,去除附着在体壁上的色素及杂蛋白;用蒸馏水清洗至中性,随即浸泡于一定浓度、一定体积的盐酸溶液中,以脱除体壁中的钙质及其他无机成分。

1.2.4单因素实验设计

1.2.4.1酸浓度对脱钙率的影响分别采取浓度为0.08、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的盐酸多棘海盘车与盐酸的料液比1∶10,提取24 h,测定溶液中的钙含量,计算脱钙率。

1.2.4.2提取时间对脱钙率的影响加入浓度为0.6 mol/L的盐酸,多棘海盘车与盐酸的料液比1∶10,改变反应时间,使反应时间分别为3、6、9、12、15、18、21、24 h,测定溶液中的钙含量,计算脱钙率。

1.2.4.3料液比对脱钙率的影响多棘海盘车与盐酸的料液比分别为1∶2.5、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30,加入浓度为0.6 mol/L盐酸,提取24 h,测定溶液中的钙含量,计算脱钙率。

1.2.5正交实验在单因素实验的基础上,以酸浓度(A)、提取时间(B)、料液比(C)3个因素进行L9(34)正交实验,因素水平见表1。

1.2.6钙含量的测定[18]

表1　正交实验因素与水平

1.2.6.1钙标准曲线的制定分别取0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL的钙标准溶液,以蒸馏水补足至总体积20 mL,加入15 mL氨性溶液(pH10),3滴铬黑-T指示剂,以EDTA标准溶液滴定,滴定终点溶液由酒红色变为蓝色,两次取平均值。以EDTA滴定体积为横坐标,钙含量为纵坐标作图,得标准曲线[14]。

1.2.6.2浸酸溶液中钙含量的测定取1 mL盐酸脱钙液,重复上述操作,记录消耗EDTA体积。根据标准曲线得到脱钙液中的钙含量。由下式得到脱钙率:

T=m×V/H×100

式中:T为脱钙率(%);m为由标准曲线得出的钙含量(mg);V为盐酸体积(mL);H为总钙含量(mg)。

1.2.7体壁的固定方法及电镜扫描样品制备分别剪取未经处理和处理后的多棘海盘车体壁,浸入8 ℃生理盐水,之后在二甲胂酸盐缓冲溶液(pH7.3)配制的3%的戊二醛溶液中浸泡2 h固定,固定后将标本分两次置入0.1 mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.4)中20 min,加入1%锇酸在室温下固定60 min,用50%、70%、90%、100%乙醇逐级脱水,浸透后以Spurr环氧树脂包埋,聚合。样品经过固定干燥后,切开横断面,断面向上,用乳胶粘附在样品桩上,放入JEE-4X真空喷镀仪上,加导电层(Au),以观测样品断面[19]。

1.2.8数据处理运用SPSS13.0统计软件进行数据分析,以Origin8.0软件作图。

2　结果与分析

2.1多棘海盘车体壁基本理化成分

从表2可以看出,多棘海盘车体壁中的主要成分是蛋白和灰分,含有少量的脂肪和糖。对于陆生动物而言,羟脯氨酸的常用换算系数为7.1;而水生动物中一般采用11.1或14.1[20]。由羟脯氨酸含量按换算系数11.1,得胶原含量为20.79%,胶原约占蛋白总量的65.09%,体壁可用于提取明胶或胶原蛋白[6,14]。

多棘海盘车体壁灰分含量为60.39%,主要为羟基磷灰石,对提取胶原蛋白十分不利。本文较郝林华等[13]的测定结果(44.44%)和王长云等[21]的测定结果(57.92%)偏高。可能是多棘海盘车采集地点、时间及检测方法的差异导致了检测结果的不同。多棘海盘车体壁灰分含量高于海水真鲷(Pagrosomusmajor)鱼鳞[22](34.2%)和淡水鳙鱼(Aristichthysnobilis)鱼鳞[23](27.4%)。多棘海盘车体壁主要由胶原纤维形成的三维立体网构成,孔洞由无机物填充[11],体壁韧性强、不易破碎,羟基磷灰石排列方式特殊。而鱼鳞表面覆盖一层以钙为主的无机物,胶原纤维分布在无机层之下[23]。构造的特殊性可能是多棘海盘车体壁灰分含量高的主要原因。

2.2多棘海盘车体壁的脱钙工艺

2.2.1盐酸浓度对脱钙率的影响由图1可得,当盐酸浓度在0.4～0.6 mol/L时,随着盐酸浓度的提高,脱钙率显著提高,当盐酸浓度大于0.6 mol/L时,钙含量脱除的速度明显变缓,且0.6 mol/L与0.8 mol/L的盐酸脱钙效果在第48 h时比较无显著性差异。这与张丰香等[24]报道的利用盐酸对鱼鳞进行脱钙的结果类似。

图1　盐酸浓度对脱钙率的影响Fig.1　Effect of concentration on decalcification rate

2.2.2时间对脱钙率的影响由图2可知,脱钙率在开始的18 h随酸处理时间的增长出现迅速增加,在21 h时浸出液中钙含量达到最大值,之后脱钙率基本不随时间增加而变化。段蕊等[25]的研究也表明,钙离子的脱出并不是匀速的,在开始的18 h非常快,在以后的18 h内,脱钙的速度有所降低,21 h后脱钙率的增加非常缓慢。

图2　时间对脱钙率的影响Fig.2　Effect of time on decalcification rate

2.2.3料液比对脱钙率的影响从图3中可以看出,随着液料比的增加,脱钙率呈波动状态。脱钙率开始呈增加趋势,在液料比为1∶10的时候达到最大值。当液料比达到1∶15时,效果最差,当液料比>1∶15时,脱钙率反而随着液料比的增加有增加的趋势。

图3　料液比对脱钙率的影响Fig.3　Effect of solid-to-liquid on decalcification rate

2.2.4正交实验结果与分析正交实验的结果与分析见表3,方差分析见表4。

表3　正交实验结果L9(34)

表4　方差分析表

由表3及表4可知,影响脱钙率的三个因素由大到小为:C>B>A,即料液比对脱钙率的影响最大,其次是脱钙时间和酸浓度,较优水平组合是A3B2C2,料液比对脱钙率的影响差异显著(p<0.05)。

根据上述优化结果,在乙酸浓度1.0 mol/L,脱钙时间21 h,料液比1∶10的优化条件下,重复5次实验,测得其平均的钙脱除率为73.85%。

2.3多棘海盘车体壁在脱钙过程中的改变

2.3.1外观形态变化图4是未经过脱钙处理和经过盐酸脱钙处理的体壁电镜扫描照片。盐酸处理前后,体壁纵切面的形态是有差别的。盐酸处理前,体壁纤维板层紧密整齐,经过切割后不松散;盐酸处理后,体壁纵切面变得松散、粗糙,出现孔洞,说明体壁在经过盐酸处理之后,形态从内到外都发生了一定的改变。多棘海盘车体壁经过盐酸脱钙处理后变得柔软,韧性增强,盐酸逐渐向内层渗透,浸润胶原纤维束,使钙化层变薄,胶原纤维束之间变得疏松。而脱钙后的鱼鳞厚度减小,透明度增强,韧性降低[12]。这体现了鱼鳞与多棘海盘车壁内部结构的不一致。鱼鳞是羟基磷灰石等钙化层覆盖在胶原纤维表面,而多棘海盘车体壁是羟基磷灰石填充胶原纤维形成的空洞。电镜观察脱钙后的多棘海盘车体壁内部结构变得松散、粗糙,并出现孔洞。

图4　经过不同处理的多棘海盘车体壁内部结构Fig.4　The internal structure of body wall after different treatment

图5　经过不同处理液处理多棘海盘车体壁内部的能谱扫描Fig.5　The energy spectrum diagram of internal structure of body wall after different treatment

2.3.2能谱扫描变化图5是盐酸处理前后多棘海盘车体壁纵切面的能谱扫描图谱。未经过盐酸处理,在体壁内层都没有发现氯,但是钙和磷的含量都较高。经过盐酸处理后,在体壁内部纤维层的能谱扫描中出现氯,而钙、磷等含量下降。说明随着盐酸溶液逐渐向内部扩散,内部结构变疏松;而钙、磷等溶解在酸液中,在浓度梯度的推动下扩散出来。能谱图显示脱钙后,盐酸溶液向多棘海盘车内部渗透,金属离子扩散出来,这点是与鱼鳞一致的[12]。各种无机离子在扩散过程中会渗入胶原层,因此脱钙后的体壁在提取胶原蛋白前应充分浸泡和清洗,防止灰分太多影响产品纯度。

3　结论

通过正交实验,优化盐酸脱除多棘海盘车体壁中钙工艺,结果表明:盐酸浓度为1.0 mol/L,脱钙时间为21 h,料液比为1∶10,体壁脱钙率可达73.85%。多棘海盘车体壁在脱钙处理后韧性增强,内部结构变得松散、粗糙。在脱钙过程中,盐酸逐渐渗透到体壁内部,无机离子从内部扩散出来。

[1]杨德渐,孙世春.海洋无脊椎动物学[M].青岛:青岛海洋大学出版社,1999:67.

[2]常丽媛,高淑华,李静辉,等.多棘海盘车的生药学研究[J].吉林中医药,2001(6):60.

[3]O Hara T.Northern Parcific seastar[J].Vic Nat,1995,112:261.

[4]Burna M,Morrice MG,Wolf B.Introduction of the northern Pacific asteroid Asterias amurensis to Tasmania:reproduction and current distribution[J].Mar Bio,1997,127(4):673-685.

[5]Spencer B E.Predators and methods of control in molluscan shelfish cultivation in North European waters[J]. EAS Special Publication,1992,16:309-338.

[6]李红艳,李晓,孙元琴,等.多棘海盘车营养成分分析及评价[J].食品科学,2014,35(21):207-211.

[7]曹荣,张媛,刘淇,等.响应面法优化多棘海盘车消化腺、生殖腺酶解工艺[J].食品研究与开发,2014,35(9):76-80.

[8]Wang Q,Ikegeme K,Takhashi K,et al.Comparison of lipids in organs of the starfish Asterias amurensis associated with different treatments[J].Oceanic and Coastal Sea Research,2013(12):413-417.

[9]刘铁铮,郑爱洁,王桂春,等.海星化学成分的生物活性剂及应用研究进展[J].广东农业科学,2011,38(13):122-125.

[10]米丽,卜淑娟,程萍,等.多棘海盘车的化学成分研究进展[J].第二军医大学报,2009,30(12):1420-1424.

[11]PATRICIA O`NEILL.Structure and mechanics of starfish body wall[J].J exp Biol,1989,147:53-89.

[12]张俊杰,段蕊,薛婉丽,等.鲤鱼鱼鳞在盐酸脱钙过程中的变化[J].氨基酸和生物资源,2009,31(1):44-47.

[13]郝林华,李八方.多棘海盘车体壁胶原蛋白的研究[J].中国水产科学,1999,6(2):18-21.

[14]王迪,罗永康,崔建云.响应面法优化武昌鱼鳞脱钙工艺的研究[J].淡水渔业,2010,40(3):61-66.

[15] 曾少葵,刘坤,吴艺堂,等.脱钙罗非鱼鱼鳞明胶提取工艺优化及其理化性质[J].南方水产科学,2013,9(2):38-44.

[16]吴波,陈运中,律佳雪,等.响应面分析法优化鱼鳞脱钙条件的研究[J].食品科学,2008,29(4):181-184.

[17]樊世芳,王利强,游柳青,等.鱼鳞胶原蛋白的研究进展[J].包装工程,2014,35(23):6-12.

[18]华中师范学校,东北师大,陕西师大编.分析化学实验[M].北京:人民教育出版社,1981.

[19]秧勇骥.实用生物医学电子显微镜技术[M].上海:第二军医大学出版社,2003:65.

[20]李莉,顾塞麟,王锡昌,等.响应面法优化酶解提取大鲵皮胶原蛋白工艺[J].中国水产科学,2013,20(4):876-883.

[21]王长云,顾谦群,周鹏.多棘海盘车用作新型海洋食品原料的可能性研究[J].中国水产科学,1999,6(4):67-71.

[22]Toshiyuki I,Histonshi K,Junzo T,et al.Physical properties of type I collagen extracted from fish scales of Pagrus major and Oreochromis niloticas[J].International Journal of Biological Marcomolecules,2003,32:199-204.

[23]曾江南,蒋柏泉,魏林生,等.鳙鱼鱼鳞脱钙工艺的优化[J].南昌大学学报,2011,33(4):338-364.

[24]张丰香,许时婴,王璋.鱼鳞明胶生产的浸酸脱钙工艺研究[J].食品工业科技,2008,29(3):119-204.

[25]段蕊,周银铃,张艳.滴定法监控鱼鳞脱钙过程的研究[J]. 淮海工学院学报:自然科学版,2004,113(2):54-59.

Study on optimization and changes of bodywall ofAsteriasamurensisin the process of decalcification

LI Xiao1,WANG Ying1,*,LI Hong-yan1,WU Zhi-hong1,LIU Tian-hong1,SUN Yuan-qin1,LIU Wei2

(1.MarineBiology Institute of Shandong Provine,Qingdao 266100,China; 2.Institue of Oceanology,Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266071,China)

The collagen fibres of the bodywall fromAsteriasamurensisform a three-dimensional orthogonal web. Voids in the web contain ossicles and papulae. The inorganic substance is mainly calcium.In order to extract collagen fromA.amurensisbodywall,inorganic layer should be detached first. Optimization and changes of bodywall during the process of decalcification was studied. Changes under influential factors were described. These factors included concentration of hydrochloric acid,solid-to-liquid ratio,and decalcification time. On the basis of single factor experiment,the results by orthogonal experiment show that the optimal conditions were hydrochloric acid concentration 1.0 mol/L,solid-to-liquid ratio 1∶10,and decalcification time 21 h. After the decalcification,the de-calcification rate can reach to 73.85%. After the decalcification,the bodywall became thin and soft. The internal structure became loose and rough. As the decalcification went on,hydrochloric acid gradually penetrated into the internal structure,metal ions diffused from the inside.

Asteriasamurensis;decalcification;bodywall;hydrochloric acid;internal structure

2015-11-24

李晓(1985-),女,硕士,助理研究员,研究方向:水产品加工,E-mail:lixiaohappy9@163.com。

王颖(1971-),女,硕士,研究员,研究方向:水产品加工与质量控制,E-mail:food_rc@sina.com。

海洋公益性行业专项经费资助项目(201205027-3)。

TS254.1

A

1002-0306(2016)10-0307-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.054