氟暴露小鼠睾丸形态计量学研究

林坤群,贺鑫晋,刘辰光,卢洪江,李宝钧,孙子龙

(山西农业大学动物科技学院,山西太谷030801)

氟暴露小鼠睾丸形态计量学研究

林坤群,贺鑫晋,刘辰光,卢洪江,李宝钧,孙子龙

(山西农业大学动物科技学院,山西太谷030801)

为了观察小鼠氟中毒睾丸形态变化特点,研究氟对睾丸的毒性影响,选用45只健康性成熟雄性昆明系小鼠,随机分为对照组、低氟组(25 mg/L NaF)、高氟组(100 mg/L NaF),连续饲喂60 d,制作睾丸石蜡组织切片,H.E.染色后,显微镜下观察曲细精管形态变化,通过定量分析方法探讨氟对睾丸的毒性影响.结果表明,与对照组相比,低氟组和高氟组曲细精管半径、面积以及曲细精管管腔半径、面积均无显著性差异(P>0.05);高氟组小鼠曲细精管细胞层数和厚度极明显低于对照组(P<0.01);形态学观察显示,25 mg/L氟中毒小鼠睾丸生精细胞减少,100 mg/L NaF可导致生精细胞排列紊乱、各级生精细胞减少等.本试验可为氟的雄性生殖毒性研究提供直观、科学的参考.

氟中毒;睾丸;曲细精管;形态计量学

氟作为一种非常活泼的卤族元素,以多种化合物形式存在于自然界中.由于其安全范围极窄,稍有过量就会造成毒性作用,氟中毒已成为全世界广泛存在的一种人畜共患性地方病,主要对动物的牙齿、骨骼造成损伤,引起氟斑牙、氟骨症等症状[1].除此之外,关于氟对非骨相系统(如生殖、神经、肾、肝、免疫等)影响的研究和报道越来越多[2].自1994年Freni[3]在一项生态学研究中提出,在一些地区总生育力和氟含量呈负相关性以来,越来越多的研究表明氟可引起生殖系统的损伤[4].本研究旨在通过对饮水染氟性成熟雄性小鼠的睾丸组织的结构进行观察并测量其曲细精管半径、管腔半径、曲细精管面积等形态计量学指标,为氟的生殖毒性研究提供理论依据与参考.

1　材料与方法

1.1试验材料45只昆明系雄性小鼠和饲料由山西医科大学实验动物中心提供,氟化钠(NaF)、Bouin's固定液、乙醇、二甲苯、苏木精、伊红等由院实验中心配制.

1.2方法

1.2.1动物模型的建立小鼠购回后进行一周的适应性饲养,随机分成3个组,进行分笼饲养,依次为对照组,低氟组,高氟组,每组15只.进行如下处理:对照组,饮用蒸馏水;低氟组饮用氟化钠浓度为25 mg/L的蒸馏水;高氟组饮用氟化钠浓度为100 mg/L的蒸馏水.自由采食、饮水.

1.2.2样本采集及切片制作饲喂60 d后脱颈椎处死,迅速取其左侧睾丸组织,生理盐水冲洗,置于Bouin's固定液中固定24 h,自来水冲洗12 h,梯度酒精逐步脱水,置二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、展片、烘片.染色前,脱蜡、染色、透明,中性树胶封片,于光镜下观察睾丸组织形态.

1.2.3统计分析每组切片取30个曲细精管,用Image-Pro Plus5.0进行测量,使用GraphPad Prism 5.0软件进行One-way ANOVA显著性检验.P< 0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著.

2　结果与分析

2.1睾丸形态计量学指标小鼠曲细精管细胞层的层数、厚度的分析结果见图1.随着氟化钠剂量的增加,曲细精管细胞层的层数和厚度逐渐减少,且高氟组极显著低于对照组(P<0.01).小鼠曲细精管半径、面积,管腔半径、面积的分析结果见图2、3.与对照组相比,氟组小鼠睾丸曲细精管半径、曲细精管面积,管腔半径、管腔面积没有显著变化.

2.2睾丸形态结构的变化对照组的曲细精管细胞排列有序,各级生精细胞分布均匀(见中插彩版图4A).25 mg/L氟中毒小鼠睾丸生精细胞减少(见中插彩版图4B),100 mg/L氟化钠可导致生精细胞排列紊乱、各级生精细胞减少(见中插彩版图4C).氟对睾丸组织的损伤存在剂量效应关系,随着氟化物的增加,曲细精管的损伤程度越明显.

3　讨论

睾丸组织主要是由生精细胞、支持细胞、间质细胞组成,从上皮基部到腔面依次为精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子.睾丸内有大量弯曲的曲细精管,其是产生精子的场所,良好的睾丸组织、结构对于精子的发生和生理功能的维持具有决定性意义.如果曲细精管内生精上皮受到化学毒物的影响,精子发生将出现障碍.

图1　不同浓度氟的小鼠曲细精管细胞层数(A)、厚度(B)

图2　不同浓度氟的小鼠曲细精管管腔半径(A)、面积(B)

图3　不同浓度氟的小鼠曲细精管半径(A)、面积(B)

研究证明,氟是一种具有生殖毒性的微量元素.当体内氟蓄积到一定的浓度,会突破了血睾屏障,对睾丸的生精功能产生毒副作用[5].氟对大鼠睾丸生长发育的毒性试验中组织病变包括精原细胞损伤,精原细胞减少,以及严重的睾丸超微结构的改变[6].饲喂含不同比例的燃煤型氟中毒病区煤烘玉米,发现大鼠睾丸生精小管发生不同程度的损害[7].Wan等[8](2006)用氟浓度为150 mg/L喂养大鼠50、80、100、120 d,随着摄氟时间延长,小鼠生精上皮细胞层数目逐渐减少,曲细精管直径越来越小.本试验中高氟组小鼠的生精上皮细胞层数目减少,曲细精管管壁变薄同样证实了这一观点;而25 mg/L与100 mg/L氟化钠组小鼠的管腔半径、曲细精管半径、曲细精管面积、曲细精管管腔面积并没有显著差异,可能与试验动物的种类、摄氟的剂量、时间、方式有关系,还需做进一步试验验证.精子是精子发生的终末环节,我们前期研究发现氟暴露造成附睾中成熟精子头、尾部中段不同程度的结构改变,尤以线粒体异常为主[9].本试验通过睾丸形态计量学指标的测定和形态学观察,证实氟中毒可导致小鼠曲细精管内生精细胞结构排列紊乱、细胞层数显著减少、厚度变薄,睾丸结构基础的破坏进一步引起功能的紊乱和丧失,最终造成不育的发生.

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S859.8

B

0529-6005(2016)06-0102-02

2015-01-25

教育部高等学校博士学科点专项科研基金(2012-1403120005);山西省青年科技研究基金(2012021027-5);山西农业大学引进人才科研启动项目(XB2010003)

林坤群(1993-),男,本科生,就读于动物生殖毒理学专业学习,E-mail:405062446@qq.com

孙子龙,E-mail:sunzilong2000@163.com.