黑山羊源野牛平腹盘吸虫ITS2基因序列测定及分析

梅雪芳,杨　磊,陶　立,李　健,黄维义,王冬英

(1.广西大学动物科学技术学院,广西南宁530005;2.广西大学食品质量与安全研究中心,广西南宁530005;3.广西兽医研究所,广西南宁530001)

黑山羊源野牛平腹盘吸虫ITS2基因序列测定及分析

梅雪芳1,2,杨磊1,2,陶立3,李健1,2,黄维义1,2,王冬英1,2

(1.广西大学动物科学技术学院,广西南宁530005;2.广西大学食品质量与安全研究中心,广西南宁530005;3.广西兽医研究所,广西南宁530001)

对首次分离自黑山羊的野牛平腹盘吸虫(Homalogaster paloniae)进行初步的形态学观察,扩增其核糖体内第二间隔转录区基因序列(the second internal transcribed spacer,ITS2)并测序,获得的序列经DNAStar软件处理和人工校对后,得到其精确的ITS2基因序列,长度为295 bp,上传至GenBank后获得的登录号为KJ561151.测序结果经对比分析后显示与分离自印度的野牛平腹盘吸虫(GU133056)ITS2基因片段序列一致性为100%.与分离自日本的野牛平腹盘吸虫(AB042190)ITS2基因序列一致性为99%,仅在第69个位点出现差异.

黑山羊;野牛平复盘吸虫;ITS2

近年来随着市场对黑山羊需求的增加,广西的黑山羊养殖业发展迅速,但寄生虫病长期阻碍草食兽的养殖.野牛平腹盘吸虫是寄生在牛羊的盲肠的一种同盘类吸虫(也称作前后盘吸虫),分布于亚洲各地[1],我国众多省份均有分布记载[2].野牛平腹盘吸虫的自然终末宿主为黄牛、水牛、山羊和绵羊等,Islam[3]等人报道,水牛感染野牛平腹盘吸虫后出现盲肠充血、淤血和严重的卡他性肠炎等症状.此前未见黑山羊感染该吸虫的报道,本次从广西某黑山羊养殖场的死亡黑山羊中分离该虫,进行形态学观察鉴定后对其核糖体内转录第二间隔区(internal transcribed spacer region 2,ITS2)序列进行测定并分析,为今后该虫引发的疾病进行分子诊断提供了合适的分子标记.

1　材料与方法

1.1虫体来源2010年剖检某黑山羊养殖场死亡黑山羊1头,从其盲肠处检获数条肠吸虫,将3虫体使用5%福尔马林液压片后,保存于10%福尔马林液中,其余虫体观察后均直接保存于70%乙醇中,备用.

1.2主要试剂卡红(Sigma公司);Taq DNA聚合酶、PCR试剂、DNA标志物(DL-2 000)和pMD18-T载体,均购自宝生物工程(大连)有限公司;DNA提取试剂盒(DNeasy Blood&Tissue kit),购自德国Qiagen公司;胶回收试剂盒,购自天根生化科技(北京)有限公司;人工胃蛋白酶,购自美国Sigma公司.

1.3方法

1.3.1盐酸卡红染色观察吸虫形态取出保存于10%福尔马林液的虫体2条,按孔繁瑶[4]记述的盐酸卡红染色法对吸虫进行染色,透明后使用中性树胶进行封片,置于显微镜下对吸虫的内部器官形态进行观察,并拍照.

1.3.2PCR扩增与测序取单条虫体,按照DNA提取试剂盒使用说明书提取虫体基因组DNA,依据Goswami[5]等的研究设计的引物,用以扩增野牛平腹盘吸虫的ITS2基因序列.上游引物(3S):5′-GG⁃TACCGGTGGATCACTTCGGCTCGTG-3′;下游引物(28R):5′-GGGATCCTGGTTAGTTTCTTTTCCTCCGC-3′),回收扩增产物,经pMD18-T载体克隆后送上海英骏生物技术有限公司测序.

1.3.3序列分析测序结果经DNAStar软件校正处理,于NCBI进行BLAST分析(http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi).

2　结果

2.1虫体形态观察对封片标本进行观察发现,其形态构造与陈心陶[2]描述的野牛平腹盘吸虫相同,据此将本次在黑山羊盲肠中分离到的吸虫鉴定为野牛平腹盘吸虫,本文对其形态不作赘述(见中插彩版图1).

2.2虫体ITS2基因测序结果PCR扩增野牛平腹盘吸虫ITS2基因,产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析,所获得的条带约为500 bp,与预期的目的片段一致.测序后获得的序列经人工校正后获得野牛平腹盘吸虫精确的ITS2片段,大小为295 bp,GC含量为52%.提交至GenBank后获得登录号为KJ561151.

2.3序列分析结果测序结果经对比分析后结果显示与分离自印度的野牛平腹盘吸虫(GU133056) ITS2基因片段序列一致性为100%.与分离自日本的野牛平腹盘吸虫(AB042190)ITS2基因序列一致性为99%,在第69个位点出现差异.

3　讨论

野牛平腹盘吸虫隶属于腹殖目(Digenea)同盘总科(Paramphistomoidea)腹盘科(Gastrodisci⁃dae)平腹属(Homalogaster)[6].此前由于同盘类吸虫虫体较肥厚,不便于进行常规的染色观察,分类鉴定工作较为繁杂,现今可通过分子生物学的方法选择合适的分子标记可弥补这一不足.吸虫的ITS2基因序列现被认为是分子鉴定吸虫种类时可信度最高的序列工具,已在同盘类吸虫的分子鉴定中得到运用[7].本文通过对黑山羊源的野牛平腹盘吸虫ITS2基因序列进行扩增测序分析,进一步支持了ITS2在吸虫的分子鉴定中是合适的分子标记.

图2　野牛平腹盘吸虫ITS2基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析

[1]Yamaguti S.System Helminthum Vol.1.The digenetic trematode of verterbrates[M].New York,Interscience,1958:971-972.

[2]陈心陶.中国动物志吸虫纲复殖目(一)[M].北京:科学出版社,1985:230-231.

[3]Islam S,Chakraborty A,Das M.Pathological studies of caecum in concurrent infection of Homalogaster paloniae and Schistosoma in⁃dicum in bovine[J].Journal of Veterinary Parasitology,1990,4 (1):45-48.

[4]孔繁瑶.家畜寄生虫学[M].2版.北京:中国农业大学出版社,1997:378.

[5]Goswami L M,Prasad P K,Tandon V,et al.Molecular Character⁃ization Of Gastrodiscoides hominis(Platyhelminthes:Trematode: Digenea)Inferred From ITS Rdna Sequence analysis[J].Parasitology Research,2009,104(6):1485-1490.

[6]Gibson D I,Jones A,Bray R A.Keys to the Trematode,Volume 2 [M].London:CABI Publishing and The Natural History Museum,2002:5-20;221-227;325-336.

[7]李健,全琛宇,石云良,等.食蟹猴体内瓦氏瓦特松吸虫ITS序列测定及其种系发育分析[J].国际医学寄生虫病杂志,2013,6(40):305-310.

Thesequencing and analysis ofHomalogaster paloniaeITS2 geneisolated from black goat

MEI Xue-fang1,2,YANG Lei1,2,TAO Li3,LI Jian1,2,HUANG Wei-yi1,2,WANG Dong-ying1,2
(1.College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Nanning 53005,China;2.Research Center of Food Quality and Safety,Guangxi University,Nanning 530004,China;3.Guangxi Veterinary Research Institute,Nanning 530004,China)

We observed the morphology of the Homalogaster paloniae isolated from black goat of Guangxi,and then amplified and sequenced the second internal transcribed spacer.The sequence were analyzed by softwares of DNAstar and checked by artifi⁃cial.Then,we acquired the accurate ITS2 sequence,and its length was 295 bp.We submitted the sequence to the GenBank and the accession number was KJ561151.Compared with the Homalogaster paloniae isolated from India and Japan,we found that the homology were 100%and 99%,respectively.The sequence had one mutation at the 69 th point when compared with the parasite isolated from Japan.

Black goat;Homalogaster paloniae;ITS2

s:LI Jian;HUANG Wei-yi;WANG Dong-ying

S858.27

A

0529-6005(2016)06-0031-02

2014-09-16

梅雪芳(1990-),女,硕士生,研究方向为预防兽医,E-mail:384280442@qq.com

李健,E-mail:leejianshin@163.com;黄维义,E-mail: wyhuang@gxu.edu.cn;王冬英:E-mail:dywang@gxu.edu.cn