牛传染性鼻气管炎病毒gE基因LAMP检测方法的建立

皇甫和平,石冬梅,许文博,徐　超,王 军,王　岩,沈永恕,史静柯

(1.河南牧业经济学院动物医学院,河南郑州450046;2.河南省出入境检验检疫局,河南郑州450003)

牛传染性鼻气管炎病毒gE基因LAMP检测方法的建立

皇甫和平1,石冬梅1,许文博1,徐超2,王 军1,王岩1,沈永恕1,史静柯1

(1.河南牧业经济学院动物医学院,河南郑州450046;2.河南省出入境检验检疫局,河南郑州450003)

根据GenBank收录的BHV-I NM06株的gE基因序列,利用软件Primer Explorer V4设计2对LAMP引物,建立IBRV gE基因的LAMP检测方法;利用重组质粒进行了敏感性检测,利用IBRV、牛病毒性腹泻-黏膜病病毒、牛轮状病毒等进行特异性试验,并对临床采集的50份奶牛鼻腔拭子DNA进行了检测.结果显示,建立的LAMP方法能对重组质粒DNA产生阳性反应,在58℃～65℃8个温度进行反应,结果无肉眼可见差异,反应最短时间达90 min时可见到阳性结果;该方法的检测下限是1.68X104拷贝/μL,对6种其他微生物呈阴性反应;50份临床样品中检出2份阳性.表明本研究初步建立了IBRV gE基因的LAMP快速检测方法,可用于IBRV分离株的鉴定以及临床样品的快速检测.

牛传染性鼻气管炎病毒;gE基因;LAMP;建立

牛传染性鼻气管炎(IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病,以鼻气管炎、眼结膜炎、高热、流产、传染性脓疱性外阴阴道炎为主要特征.该病被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告动物疫病,我国多个省市均有IBR抗体阳性的报道[1].

目前针对IBRV的感染,诊断方法主要有ELISA、PCR、qPCR等[2].但这些方法操作较为繁琐,PCR和 qPCR需要较为贵重的仪器,在普通兽医实验室推广具有一定的局限性.环介导等温扩增技术(Loopmediated isothermal amplification,LAMP)是一种体外核酸扩增技术,由日本学者Notomi等发明[3].该方法利用2-3对引物,特异性的结合于靶基因的6个位点,具有特异性强,敏感性高,尤其是操作简单,无需昂贵的仪器的优点.本研究初步建立了IBRV gE基因的LAMP检测方法,可用于IBRV DNA的体外快速检测,适合于在普通兽医实验室推广应用.

1　材料

1.1菌株和毒株IBRV、牛病毒性腹泻-黏膜病病毒、牛轮状病毒疫苗毒、α溶血性链球菌、β溶血性链球菌、魏氏梭菌和猪流感病毒均为本实验室保存.

1.2主要试剂通用型LAMP恒温扩增试剂盒和LAMP可见光染料,购自北京天恩泽生物技术有限公司;Taq PCR Master Mix、DNA Marker-D、4S Green核酸染料、EAUP柱式病毒DNA抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒,均购自上海生工生物工程技术服务有限公司.

1.3LAMP扩增引物根据GenBank收录的BHV-1 NM06株的gE基因序列(登录号:GU591891.1),利用在线软件Primer Explorer V4(http://primerex⁃plorer.jp/elamp4.0.0/index.html)设计2对LAMP引物,并通过BLAST软件进行在线比对分析验证.4条引物序列见表1.

表1　LAMP引物及部分gE基因片段序列

1.4重组质粒的构建参考BHV-I NM06株的gE基因序列和LAMP扩增区域,合成该基因的部分片段序列(225 bp),并通过Sma I位点克隆至pUC57质粒中,重组质粒命名为pUC57-gE.合成基因的序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,见表1.

1.5LAMP扩增体系的建立及优化参考通用型LAMP扩增试剂盒的操作步骤,以pUC57-gE质粒为DNA模板,建立反应体系:LAMP Mix(2X)10 μL、FIP引物终浓度0.8 μmol/L、BIP引物终浓度0.8 μmol/L、F3引物终浓度0.2 μmol/L、B3引物终浓度0.2 μmol/L、MgCL2(25 mmol/L)3 μL、模板DNA (1.48X107拷贝/μL)0.5 μL、Bst DNA聚合酶(8 U/ μL)1.5 μL、LAMP可见光染料1 μL、补水到20 μL.

反应过程如下:将各组分混匀,分别在58、59、60、61、62、63、64、65℃保温,反应时间在30、45、60、75、90、105 min和120 min 7个时间段进行优化,80℃10 min灭活Bst DNA聚合酶.结果观察,直接观察反应液颜色变化,如果发生LAMP扩增,颜色由反应前的浅紫色变成天蓝色,并显浑浊;如不加可见光染料,观察浑浊度的变化.

1.6灵敏度和特异性检测将重组质粒(1.68X 1010拷贝/μL)做10倍倍比稀释,以不同稀释度的质粒溶液为模板进行LAMP检测.

以IBRV、牛病毒性腹泻-黏膜病病毒、牛轮状病毒疫苗毒、猪流感病毒、α溶血性链球菌、β溶血性链球菌和产气荚膜梭菌的基因组DNA或反转录得到的cDNA为模板,进行LAMP检测,并设置无模板空白对照.上述病原DNA或cDNA的浓度分别为1.48X107拷贝/μL、3.07X1011拷贝/μL、6.6X 1010拷贝/μL、3.1X1011拷贝/μL、2.18X106拷贝/μL、7.97X107拷贝/μL、2.79X105拷贝/μL.

1.7临床样品检测参考病毒DNA抽提试剂盒操作步骤,对2014年在河南省濮阳、周口、太康等地采集的50份奶牛鼻腔棉拭子抽提DNA后,进行LAMP检测.

2　结果

2.1LAMP扩增体系的建立及反应条件优化根据LAMP扩增试剂盒的操作步骤,在不加LAMP可见光染料时,肉眼观察可见空白对照呈透明清亮状,而重组质粒扩增呈浑浊状,见图1.加入可见光染料时,标准质粒扩增后颜色变成天蓝色,并显浑浊,空白对照仍呈浅紫色,透明,见图2.

图1　未添加可见光染料的LAMP反应

图2　添加可见光染料的LAMP反应

通过对58℃～65℃8个温度下进行反应的结果观察,发现上述不同温度对反应结果无影响,见图3;通过在7个时间点观察,发现90 min后,阳性结果明显,见图4.

图3　温度敏感性试验

图4　时间敏感性试验

2.2特异性、敏感性试验结果用建立的LAMP方法检测7种病原微生物,结果显示,只有IBRV为阳性,其余均为阴性,见图5.该方法对10份不同稀释度的标准质粒模板检测,最低可检测到1.68X104拷贝/μL,见图6.

图5　特异性试验

图6　敏感性试验

2.3临床样品检测结果用建立的LAMP检测方法对2014年采集的50份奶牛鼻腔棉拭子DNA检测,结果有2份为阳性.

3　讨论

本研究初步建立了IBRV gE基因的LAMP检测方法.主要选择牛的常见病原微生物进行特异性试验,包括牛病毒性腹泻-黏膜病病毒、牛轮状病病毒、α-溶血性菌、β-溶血性链球菌和产气荚膜梭菌等,该方法特异性强,仅对IBRV有阳性反应,其他为阴性;敏高度较高,检测下限为1.68X 104拷贝/μL;反应时间较短,90 min即可.该方法操作简单,不需要贵重的仪器,仅需要一台恒温水浴锅,肉眼即可判断结果,可用于IBRV的快速鉴定,尤其适合在兽医临床一线进行应用.

该方法对临床中采集的50份奶牛鼻腔棉拭子DNA进行了检测,有2份阳性,对应的牛具有红鼻子、呼吸道感染等症状,与临床诊断(IBR)一致,同时也进一步在分子水平验证了该病例的诊断.IBRV具有潜伏感染的特性,血清学阳性即代表动物感染,以往课题组对河南省奶牛IBR血清学检测的阳性率59.29%[4],说明河南省奶牛群中IBRV感染普遍,而此次在50份临床样品中仅检测出2份阳性,阳性率为4%,表明当前牛群中发病的或处于散毒期的牛只比例较低.

LAMP检测方法在具有高灵敏度的同时,也使得其比普通PCR扩增更加容易污染导致假阳性,应高度重视扩增产物的污染,常规措施包括使用可见光染料,反应后不开盖直接进行肉眼检测;严格实验分区,反应体系配制区、样本处理加样区、反应和结果分析区;在进行电泳检测时,可选择其他距离较远实验室;如果实验室一旦遭到污染,所有相关试剂必需全部更换,必要时更换实验室[5].

IBRV具有持续感染和潜伏感染的特点,这给该病的根除计划造成很大难度.基因缺失疫苗免疫是控制该病的有效措施,但想根除该病,需要有相应的区分强弱毒的诊断方法.本研究针对IBRV的gE基因建立了LAMP快速检测技术,为进一步开发针对gE基因缺失的IBRV疫苗鉴别诊断方法奠定了基础.

[1]邹世颖,何倩妮,刘蕾,等.中国北方六省市牛传染性鼻气管炎病流行病学分析[J].中国兽医杂志,2012,48(2):47-48.

[2]徐晓琴,冷雪,李真光,等.牛传染性鼻气管炎诊断方法研究进展[J].动物医学进展,2010,31(1):81-86.

[3]Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et al.Loop-mediated iso⁃thermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res,2000,28 (12):63-68.

[4]石冬梅,王岩,张华,等.河南省奶牛传染性鼻气管炎血清学调查[J].畜牧与兽医,2011,43(6):67-68

[5]周广舟,徐苏丽,谭晓荣,等.LAMP技术在动物病毒病原检测中的应用进展[J].中国人兽共患病学报,2013,29(2): 179-182.

Development of a LAMP assay for detecting gE geneof Infectious BovineRhinotracheitis virus

HUANG FU He-ping1,SHI Dong-mei1,XU Wen-bo1,XU Chao2,WANG Jun1,WANG Yan1,SHEN Yong-shu1,SHI Jing-ke1
(1.Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou 450046,China; 2.Henan Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau,Zhengzhou 450003,China)

Two pairs of LAMP primers were designed using the software Primer Explorer V4 to establish the detection method for IBRV based on,the gE gene sequence of NM06 IBRV strain.The detection limit was measured using the recombinant plasmid DNA.Seven microorganisms,including IBRV,Bovine virus diarrhea mucosal disease virus,Bovine rotavirus vaccine,etc.,were used to assess the specificity of the assay.In addition,the method was evaluated with 50 clinical samples collected from dairy cat⁃tle.The results showed that,the established method turned a positive response to the recombinant plasmid DNA,and showed no visible differences from 58℃～65℃,with the shortest response time of 90 min and the low detection limit of 1.68X104copies/μL,and there were no positive reaction to 6 other microorganisms,and 2 positive reaction in 50 clinical samples.In conclusion,we es⁃tablished a rapid LAMP method for the detection of gE gene,which can be used for the identification of IBRV isolates and rapid detection of clinical samples.

Infectious Bovine Rhinotracheitis virus;gE gene;LAMP;Development

SHI Dong-mei

S852.65

A

0529-6005(2016)06-0014-03

2015-07-31

河南省重大科技攻关计划项目(132102110053);河南省教育厅科技攻关计划项目(13B230335、14B230006)

皇甫和平(1977-),男,讲师,博士,主要从事动物疾病发病机理研究,E-mail:hepinghf@163.com

石冬梅,E-mail:dongmeishi126@126.com