乳酸足球菌精氨酸代谢与瓜氨酸积累

杨怡敏，方芳，周朝晖，陈坚，堵国成*（1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡21122；2.江南大学生物工程学院，江苏无锡21122；3.江南大学食品安全与营养协同创新中心，江苏无锡21122；.广东珠江桥生物科技股份有限公司，广东中山52815）

乳酸足球菌精氨酸代谢与瓜氨酸积累

杨怡敏1，2，3，方芳1，2，3，周朝晖4，陈坚1，2，堵国成*1，2
（1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学生物工程学院，江苏无锡214122；3.江南大学食品安全与营养协同创新中心，江苏无锡214122；4.广东珠江桥生物科技股份有限公司，广东中山528415）

酿造酱油中氨基甲酸乙酯的主要前体物质瓜氨酸由乳酸足球菌通过精氨酸代谢产生。为了研究酱油中瓜氨酸的积累机制，以分离自酱油成曲的乳酸足球菌Pediococcus acidilactici BBE 1120为研究对象，考察不同培养条件（碳源、盐浓度、氨基酸）对其积累瓜氨酸的影响。结果表明，高盐环境是导致乳酸足球菌积累瓜氨酸的关键因素，碳源的种类及浓度对瓜氨酸的积累也有一定影响，培养基中精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸含量对瓜氨酸的积累影响不大。该研究结果对阐明酱油发酵过程中氨基甲酸乙酯前体物质的积累机制具有重要意义。

酱油；氨基甲酸乙酯；乳酸足球菌；精氨酸脱亚胺酶途径；瓜氨酸

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，简称EC）又称尿烷、乌拉坦，国际癌症研究机构（IARC）在2002年将氨基甲酸乙酯归类为第2B组（或可能令人类患癌的物质），经2007年再次评估后又将其改为第2A组（可能令人类患癌的物质）［1］。人体摄入氨基甲酸乙酯后，可通过以下几条途径对其进行代谢：以尿的形式将5%的氨基甲酸乙酯排出体外；通过肝内酯酶的作用，将90%以上的氨基甲酸乙酯分解为乙醇、氨和碳水化合物等（这种途径是无毒性的）；通过细胞色素P450的作用，将0.5%左右的氨基甲酸乙酯氧化为乙烯基-氨基-甲酸乙酯，然后形成乙烯基-氨基-甲酸乙酯环氧化物，这种环氧化物在体内形成DNA加聚物，能破坏DNA双链，最终导致机体癌变；另外，同样通过细胞色素P450的作用，能将0.1%左右的氨基甲酸乙酯氧化为N-羟基-氨基甲酸乙酯，后者能够诱导Cu2+调控的DNA损伤，该种途径是较为普遍的一种［2］。因此，当氨基甲酸乙酯被人体过量持续摄入时，可能会导致肺癌、肝癌等严重肿瘤疾病，对免疫系统造成极大损害。

氨基甲酸乙酯是某些发酵食品在发酵过程中经由微生物代谢产生的可致癌物质，酱油中就含有一定量的氨基甲酸乙酯。酱油是一种有着悠久历史的传统调味品，受到世界各地的广泛欢迎，与人们的日常饮食密切相关。而酱油中氨基甲酸乙酯的存在可能会导致酱油潜在的不安全性，因此迫切需要了解酱油中氨基甲酸乙酯的形成机制，以便采取相应控制措施。

在不同的发酵食品中，由于原料、参与的微生物以及发酵工艺等因素的不同，氨基甲酸乙酯的形成机理也各不相同，尿素、氨甲酰磷酸、瓜氨酸、焦碳酸二乙酯和氰化物等均可与乙醇反应生成氨基甲酸乙酯［3-5］。而在酱油发酵过程中，氨基甲酸乙酯的主要前体物质是瓜氨酸和乙醇，其中瓜氨酸主要是由酱醪中的乳酸菌经由精氨酸脱亚胺酶途径（Arginine deiminase pathway，简称ADI途径）降解精氨酸产生［6］，该途径主要涉及3个酶，分别为精氨酸脱亚胺酶（Arginine deiminase，简称ADI），鸟氨酸转氨甲酰酶（Ornithine transcarbamylase，简称OTC），氨基甲酸激酶（Carbamate kinase，简称CK），其具体反应如下：

在高盐稀态酱油的制备过程中，发酵前期是瓜氨酸的快速生成时期，乳酸足球菌是酱油中生成与积累瓜氨酸的主要微生物［6］。乳酸菌的ADI途径受到环境因素的调控，例如Vrancken等研究发现，pH、盐浓度、温度对Lactobacillus fermentum IMDO 130101的ADI途径有所影响［7-8］。糖类等涉及能量代谢的物质也可能对ADI途径产生影响［9-10］。在不同的环境因素下，ADI途径反应产物中瓜氨酸和鸟氨酸的比例也会随之变化。根据高盐稀态酱油酿造工艺，以乳酸足球菌Pediococcus acidilactici BBE 1120为研究对象，考察不同环境因素（碳源、盐浓度、涉及ADI途径的3种氨基酸）对其精氨酸代谢与酱油中氨基甲酸乙酯前体物质瓜氨酸积累的影响。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

高盐稀态酱油样品，取自广东某酱油厂；乳酸足球菌Pediococcus acidilactici BBE 1120，分离自酱油成曲；MRS培养基，购自英国Oxiod公司；精氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸标样，购自上海生工生物工程股份有限公司；CO2气体，购自江苏省无锡市新南化学气体有限公司。

1.2仪器与设备

厌氧培养箱，三洋公司制造；PHS-3C型酸度计，杭州亚美电子仪器厂制造；1200型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司制造。

1.3方法

1.3.1测定酱油发酵过程样品中糖的种类与含量取酱油厂成曲拌盐水后的第0、1、4、7天的高盐稀态酱油样品，采用8 000 r/min离心样品5 min，取上清液。准确移取3.0 mL上清液至10.0 mL容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，充分摇匀，8 000 r/min对其离心10 min。移取1.0 mL上清液至50.0 mL容量瓶中，氮吹仪吹干后，用超纯水稀释至刻度，取3.0 mL过0.22 μm尼龙滤膜后用于高效阴离子交换色谱分析［11］。

1.3.2不同培养条件对乳酸足球菌经由ADI途径积累瓜氨酸的影响从乳酸足球菌甘油管中取菌液划线至MRS固体培养基，于37℃厌氧培养箱中培养20 h，挑取单菌落接种至50 mL MRS培养基，于37℃厌氧培养箱中培养20 h，采用8 000 r/min离心培养液5 min。弃上清液，用pH 7.0的PBS缓冲液洗涤菌体两次，弃上清液，收集菌体，将菌体加入相应的培养体系，充分悬浮后于37℃厌氧培养箱培养。培养开始前取样品1 mL，培养后定期取样。

考察不同糖对乳酸足球菌经由ADI途径积累瓜氨酸的影响时，培养体系分别为：含有5 g/L精氨酸，不同质量浓度葡萄糖（0、2、4、6、8 g/L）的MRS培养基（pH 5.5）；含有5 g/L精氨酸，不同质量浓度甘露糖（0、3、6、9、12 g/L），不含葡萄糖的MRS培养基（pH 5.5）；含有5 g/L精氨酸，不同质量浓度蔗糖（0、8、16、24、32、40 g/L），不含葡萄糖的MRS培养基（pH 5.5）。培养4 d后取样用于HPLC分析。

考察NaCl质量浓度对乳酸足球菌经由ADI途径积累瓜氨酸的影响时，培养体系为含有5 g/L精氨酸的MRS培养基（pH 5.5），其NaCl质量浓度分别为0、10、16、18、20、22 g/dL，培养7 d后取样用于HPLC分析。

考察额外添加ADI途径中3种氨基酸对乳酸足球菌经由ADI途径积累瓜氨酸的影响时，培养体系分别为：含有18 g/dL NaCl，不同质量浓度精氨酸（0、2.5、5、10、20 g/L）的MRS培养基（pH 5.5）；含有18 g/dL NaCl，5 g/L精氨酸，不同质量浓度瓜氨酸（0、2.5、5、10、20 g/L）的MRS培养基（pH 5.5）；含有18 g/dL NaCl，5 g/L精氨酸，不同质量浓度鸟氨酸（0、1.9、3.8、7.6、15.2 g/L）的MRS培养基（pH 5.5）。培养7 d后取样用于HPLC分析。

1.3.3氨基酸的测定待测定样品的处理方法：采用8 000 r/min离心样品5 min，取200 μL上清液，加入800 μL三氯乙酸以沉淀蛋白质，用0.22 μm水系滤膜对其过滤处理后用于游离氨基酸的测定。游离氨基酸的测定采用高效液相色谱法［12］。

2　结果与讨论

2.1酱醪中糖的种类及含量分析

研究碳源对乳酸足球菌经由ADI途径积累瓜氨酸的影响时，主要考察酱醪中糖类物质对菌株积累瓜氨酸的影响。由于在高盐稀态酱油制备过程中，发酵前7 d是瓜氨酸的快速积累时期，因此首先对酱油发酵前7 d酱醪中糖类物质的种类及含量进行了分析，结果如表1所示。

表1　高盐稀态酱油发酵前期样品中糖的种类及含量Table 1　Quantification of sugars in morimi

在酱油前期发酵过程中，酱醪中主要含有葡萄糖，甘露糖和蔗糖等糖类物质。对酱醪进行离心处理后，在其上清液中，葡萄糖的质量浓度在0～7 g/L，甘露糖的质量浓度在0～10 g/L，蔗糖质量浓度最高，在0～38 g/L。

2.2碳源对乳酸足球菌积累瓜氨酸的影响

原料中碳源的种类及含量会影响菌体的生长，也会对菌体的代谢产生一定影响。乳酸菌精氨酸代谢途径可能会受到碳源等能量物质的影响［9-10］，因此考察了发酵前期酱醪中主要的3种糖类物质对乳酸足球菌经由ADI途径积累瓜氨酸的影响，结果如图1所示。

在不含糖类物质时，瓜氨酸的转化率为0.18。随着葡萄糖质量浓度的升高，瓜氨酸的转化率也随之升高，当葡萄糖质量浓度为8 g/L时，瓜氨酸的转化率达到0.35。随着甘露糖质量浓度的升高，瓜氨酸的转化率先升高后下降，在甘露糖质量浓度为6 g/L时，瓜氨酸的转化率最高，达到0.38。随着蔗糖质量浓度的升高，瓜氨酸的转化率亦是先升高后下降，在蔗糖质量浓度为24 g/L时，瓜氨酸的转化率最高，达到0.34。在整个ADI途径中，由CK催化的反应是产能反应。在碳源（糖类物质）充足的情况下，该步反应可能会被抑制，进而由OTC催化的反应也会受到抑制，瓜氨酸积累量可能会因此上升。

2.3食盐质量浓度对乳酸足球菌积累瓜氨酸的影响

在高盐稀态酱油发酵过程中，酱醪中NaCl的质量浓度常高达18 g/dL，高盐环境对酱醪中微生物的代谢会产生一定影响，进而可能会对瓜氨酸的积累造成影响。因此，考察了NaCl对乳酸足球菌经由ADI途径积累瓜氨酸的影响，结果如图2所示。

在不同NaCl质量浓度培养条件下，乳酸菌瓜氨酸转化率呈现出差异。在无NaCl情况下，乳酸足球菌少量积累瓜氨酸，瓜氨酸的转化率为0.29。随着NaCl质量浓度的升高，乳酸足球菌瓜氨酸的转化率也随之升高，在NaCl质量浓度为22 g/dL时转化率几乎达到100%，即精氨酸全部转化生成为瓜氨酸，而瓜氨酸并未进一步转化生成鸟氨酸。换言之，NaCl的存在一定程度上抑制了瓜氨酸向鸟氨酸的进一步转化，导致瓜氨酸的积累。而高盐稀态酱油发酵过程中NaCl质量浓度高达18 g/dL，这一高盐环境会导致瓜氨酸的大量积累。

图2　NaCl质量浓度对乳酸足球菌积累瓜氨酸的影响Fig.2　Effect of NaCl on citrulline accumulation by P. acidilactici

2.4精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸对乳酸足球菌积累瓜氨酸的影响

ADI途径中涉及3种氨基酸的代谢，分别为精氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸。这3种氨基酸的质量浓度可能影响乳酸足球菌的ADI途径，进而对瓜氨酸积累造成影响。因此，考察了额外添加这3种氨基酸对瓜氨酸积累的影响，结果如图3所示。

当培养体系精氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸质量浓度不同时，除在不添加精氨酸，18 g/dL NaCl浓度的MRS培养基中不积累瓜氨酸外，其它培养体系中瓜氨酸转化率差异不大，均大于80%。

图3　添加3种氨基酸对乳酸足球菌积累瓜氨酸的影响Fig.3　Effect of additions of amino acids on citrulline accumulation by P.acidilactici

3　结语

本实验结果表明，NaCl质量浓度是影响乳酸足球菌积累瓜氨酸的一个重要因素。在培养基含有18 g/dL NaCl的培养条件下，乳酸足球菌瓜氨酸对精氨酸的转化率大于80%，只要乳酸足球菌在培养体系中对精氨酸的降解时间够长，瓜氨酸会大量积累。因此，在高盐稀态酱油酿造过程中，高盐环境是导致氨基甲酸乙酯前体物质瓜氨酸积累的一个关键因素。此外，碳源（糖类物质）的种类及含量对瓜氨酸积累亦有一定影响，在碳源缺乏时，瓜氨酸转化率较低；随着碳源含量的升高，瓜氨酸的转化率呈上升趋势。而额外添加精氨酸等3种氨基酸对瓜氨酸积累影响不大。

目前，尚未见有如何降低酱油中氨基甲酸乙酯含量的研究报道。而本研究结果可为如何调整高盐稀态酱油酿造相关工艺，以降低氨基甲酸乙酯前体物质，进而为减少或控制酱油中氨基甲酸乙酯含量，提供研究思路和理论基础。

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Arginine Metabolism and Citrulline Accumulation of Pediococcus acidilactici

YANG Yimin1，2，3，FANG Fang1，2，3，ZHOU Zhaohui4，CHEN Jian1，2，DU Guocheng*1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Collaborative Innovation Center of Food Safety and Nutrition，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；4.Guangdong Pearl River Bridge Biological Limited Corporation，Zhongshan 528415，China）

Citrulline，a major precursor of ethyl carbamate in soy sauce，is produced by Pediococcusacidilactici via the arginine deiminase pathway.The effect of cultural conditions to citrulline accumulation of Pediococcus acidilactici BBE 1120 strain isolated from koji was investigated through carbon sources，salt concentration，and amino acids.The mechanism of citrulline accumulation in soy sauce was discussed.The high concentration of NaCl was demonstrated as the key factor to citrulline accumulation of the strain.The types and concentrations of carbohydrates also affected the citrulline accumulation，while insignificant influence was observed with the presence of arginine，citrulline and ornithine.This study is of great importance on the illustration of the accumulation mechanism for ethyl carbamate precursor during soy sauce fermentation.

soy sauce，ethyl carbamate，Pediococcusacidilactici，arginine deiminase pathway，citrulline

Q 93-3

A

1673—1689（2016）03—0247—05

2014-11-25

国家自然科学基金项目（31371821）；国家973计划项目（2012CB720802）。

堵国成（1965—），男，江苏常州人，工学博士，教授，博士研究生导师，主要从事代谢工程、发酵过程优化与控制等领域的研究。E-mail：gcdu@jiangnan.edu.cn