诃子与草乌不同比例配伍对3种双酯型生物碱含量的影响

赵爱娟，李　红，图　雅，李　霄*

(1.北京工业大学生命学院，北京 100124；2.中国中医科学院，北京 100700)



·方药研究·

诃子与草乌不同比例配伍对3种双酯型生物碱含量的影响

赵爱娟1，李红1，图雅2*，李霄1*

(1.北京工业大学生命学院，北京 100124；2.中国中医科学院，北京 100700)

目的建立草乌中主要毒性成分3种双酯型生物碱的HPLC含量测定方法，并测定其含量，探讨诃子-草乌不同比例配伍对3种双酯型生物碱含量的影响，阐释配伍减毒的原理。方法采用HPLC含量测定方法对3种双酯型生物碱进行含量测定,色谱条件为:采用Extend C18柱(4．6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇-0．05%氨水流动相梯度洗脱，柱温30 ℃，检测波长235 nm，流速1 mL/min。结果诃子-草乌不同比例(草乌单煎、0．5∶1、1∶1、2∶1、3．3∶1、5∶1)配伍合煎后，3种双酯型生物碱含量变化趋势略有不同。在水煎液中，3种双酯型生物碱总含量表现出先升高后降低的抛物线状趋势。在诃子-草乌(2∶1)合煎液中3种双酯型生物碱总含量最大，在诃子-草乌(5∶1)合煎液中3种双酯型生物碱总含量最低且低于单煎液。结论诃子-草乌不同比例配伍对水煎液中3种双酯型生物碱的含量具有很大影响，一方面促进3种双酯型生物碱的溶出，另一方面在诃子配伍比例较高时，又加速了生物碱的水解。

草乌；诃子；配伍；HPLC；双酯型生物碱

草乌为毛茛科植物北乌头(AconitumkusnezoffiiReichb．)的干燥块根[1]。据《无误蒙药鉴》记载，草乌是蒙药泵阿的一种，其生品有剧毒[2]。草乌在蒙医药中主要以干燥的母根入药，性温，味辛，效轻，有大毒，具有杀“黏”，燥“协日乌素”，止痛等多种功效，常用于多种疾病及疑难杂症的治疗。其发挥药效作用主要成分是乌头碱，次乌头碱和新乌头碱，同时也是其毒性成分，误食或用药不慎则发生中毒[3]。诃子为使君子科植物诃子(TerminaliachebulaRetz．)或绒毛诃子(TerminaliachebulaRetz．var．tomentellaKurt．)的干燥成熟果实，所含化学成分丰富多样，主要包括鞣质类、酚酸类、三萜类、黄酮类、挥发油等成分[4]，用于治疗多种疾病。

在蒙医用药时草乌多与大量的诃子配伍使用或经过诃子炮制后入药[5-7]，李瑞等[8]统计出在《蒙药方剂》中有草乌的方剂39个，而其中19个方剂同诃子配伍，这表明草乌与诃子的配伍能在一定程度上缓解草乌的毒性，且主要与诃子中含有的鞣质类成分有关，但对于诃子是如何在配伍中降低草乌毒性的目前并不十分明确[9-10]。本研究通过对诃子草乌不同配伍比例水煎液中主要毒性成分3种双酯型生物碱的含量检测，从化学成分分析的角度分析配伍规律，解释诃子与草乌配伍减毒的科学内涵，为蒙医药处方中诃子-草乌配伍应用提供一定的科学依据。

1　仪器与试药

Agilent 1200分析型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Millipore MilliQ超纯水制备仪(LABCONCO公司)；METTLER AE 240型电子天平(十万分之一，瑞士梅特勒公司)；Rotavapor R-200旋转蒸发仪(瑞士步琪BUCHI公司)；电热套(上海树立仪器仪表有限公司)；0．45 μm过滤膜(美国Millipore公司)。

新乌头碱、乌头碱、次乌头碱(成都曼思特生物科技有限公司，批号依次为MUST-14100909、MUST-15013008、MUST-14100908，供含量测定用)，甲醇(色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司)，氯仿(分析纯，北京化工厂)，硅藻土(化学醇，天津市福晨化学试剂厂)，去离子水(Millipore MilliQ超纯水制备仪制备)；草乌由内蒙古医科大学蒙医药学院松林教授提供，并鉴定为为毛莨科植物北乌头(AconitumkusnezoffiiReichb．)的干燥块根。诃子由内蒙古医科大学蒙医药学院松林教授提供，并鉴定为使君子科植物诃(TerminaliachebulaRefz．)的干燥成熟果实。

2　方法与结果

2．1对照品溶液制备精密称取新乌头碱对照品1．8 mg置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成浓度为0．360 mg/mL单一对照品储备液，再精密量取新乌头碱对照品储备液2 mL置于10 mL容量瓶中，以甲醇定容，即得新乌头碱质量浓度为0．072 mg/mL对照品溶液；精密称取乌头碱对照品11．0 mg置于2 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成乌头碱浓度为5．500 mg/mL单一对照品溶液；精密称取次乌头碱对照品5．4 mg置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成浓度为1．080 mg/mL单一对照品储备液，精密量取0．6 mL单一对照品储备液于5 mL容量瓶中，加甲醇定容，得浓度为0．129 6 mg/mL的稀释液，再精密量取稀释液0．4 mL于5 mL容量瓶中，加甲醇定容，得浓度为0．010 4 mg/mL二级稀释液。

2．2供试品的制备2．2．1草乌、诃子单煎液的制备分别精密称取草乌、诃子粗粉各5g，置于1 000 mL圆底烧瓶中，加水10倍量，回流提取30 min，纱布过滤，再将药渣加水10倍量，回流提取20 min，过滤，合并滤液，将滤液用旋转蒸发仪浓缩至膏状，加入10 g硅藻土拌匀，晾干，再用氯仿50 mL回流提取2次，20 min/次，合并氯仿提取液，回收氯仿，甲醇溶解，转移至2 mL容量瓶，甲醇定容，混匀，用0．45 μm有机系滤膜过滤，备用。

2．2．2合煎液的制备分别精密称取诃子粗粉2．5、5、10、16．67、25 g，分别与精密称取的草乌粗粉5 g混匀，使其质量比分别为0．5∶1、1∶1、2∶1、3．3∶1、5∶1，按照2．2．1项所述处理样品。

2．2．3药渣提取液的制备取草乌单煎、诃子-草乌合煎2次后，经纱布过滤后的残留药渣，迅速用适量纯水清洗2次，过滤，取药渣，加入硅藻土5 g拌匀，晾干，再用氯仿50 mL回流提取2次，每次20 min，合并氯仿提取液，回收氯仿，甲醇溶解，转移至1 mL容量瓶，甲醇定容，混匀，用0．45 μm有机系滤膜过滤，备用。2．3色谱条件Extend-C18色谱柱(4．6 mm×50 mm，5 μm)；流动相:甲醇(B)-0．05%氨水(D)梯度洗脱，0～5 min，40%～45%(B)；5～10 min，45%～55%(B)；10～16 min，55%～56%(B)；16～22 min，56%～65%(B)；22～32 min，65%～71%(B)；32～40 min，71%～80%(B)；40～47 min，80%～83%(B)；47～53 min，83%～92%(B)；53～58 min，92%～95%(B)；58～60 min，95%～100%(B)；流速为 1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长为235 nm；进样量20 μL。

2．4线性关系考察分别精密吸取浓度为0．072、5．500、0．010 368 mg/mL的新乌头碱、乌头碱、次乌头碱对照品溶液，分别注入液相色谱仪，以峰面积为纵坐标，进样量(μL)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程:新乌头碱Y=853．65X+11．41，r=0．999 8；乌头碱Y=666．06X+3 334．5，r=0．995 5；次乌头碱Y=1 157．9X+0．529 2，r=0．999 1。结果表明新乌头碱、乌头碱和次乌头碱分别在0．07～1．44 μg，5．50～165．00 μg，0．010～0．083 μg呈良好的线性关系。

2．5精密度实验精密吸取混合对照品溶液，注入液相色谱仪，重复进样5次，按2．3项下色谱条件进行检测，记录峰面积，新乌头碱、乌头碱、次乌头碱峰面积的RSD分别为0．9%、1．6%、0．9%，出峰时间RSD为0．1%、0．1%、0．08%，表明仪器精密度良好。

2．6重复性试验取同一批药材粉末约5 g，共5份，精密称定，照2．2．1项下方法制备供试品溶液，按2．3项下色谱条件进行检测，记录峰面积，新乌头碱、乌头碱、次乌头碱峰面积的RSD分别为0．7%、1．5%、0．9%，表明实验方法重复性良好。

2．7稳定性试验取2．2．1项下供试品溶液，分别于1、2、5、15、24 h进样测定。结果乌头碱、次乌头碱、新乌头碱RSD分别为1．2%、1．2%、1．2%，表明溶液在24 h内基本稳定。

2．9专属性试验精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、诃子单煎液、硅藻土回流提取液各20 μL，按按2．3项下色谱条件进行检测，结果表明新乌头碱、乌头碱、次乌头碱的出峰时间分别是30．3、36．6、42．5 min，与相邻色谱峰达到色谱分离，峰形对称，且诃子、硅藻土对3种生物碱峰无干扰。

2．10样品测定取2．2项下供试品溶液，按2．3项下色谱条件进行检测，结果诃子草乌比例为(0∶1、0．5∶1、1∶1、2∶1、3．3∶1、5∶1)时，新乌头碱的平均含量29．927、12．489、7．821、0．067、0．000、0．000 μg/g，乌头碱平均含量846．148、2 389．087、2 800．365、3 092．950、1 419．239、775．000 μg/g，次乌头碱平均含量23．160、2．309、2．490、3．203、1．219、0．931 μg/g，药渣中3种生物碱总含量65．647、44．770、43．031、25．429、100．826、104．653 μg/g，沉淀中3种生物碱总含量12．913、30．828、36．536、12．661、9．604、7．242 μg/g。

3　讨论

通过对草乌与诃子不同比例合煎液中新乌头碱、乌头碱、次乌头碱3种双酯型生物碱含量的检测，可以看出诃子与草乌不同比例配伍合煎，可显著改变水煎液中3种双酯型生物碱的含量。

在3种双酯型生物碱中，乌头碱的含量远远超过其他2种双酯型生物碱，所以乌头碱的变化趋势也基本代表了3种双酯型生物碱变化趋势。在诃子与草乌不同比例配伍煎煮中，3种双酯型生物碱含量的变化呈现抛物线形状，在诃子-草乌比例为(草乌单煎、0．5∶1、1∶1、2∶1)进行配伍时，3种双酯型生物碱总量呈现上升趋势，分析其原因，应该是诃子中鞣质成分促进了生物碱的溶出，同时在上述比例下，也能降低3种双酯型生物碱的水解程度；在诃子-草乌比例为(2∶1、3．3∶1、5∶1)配伍时，3种双酯型生物碱总量呈现下降趋势，原因是随着诃子比例的增高，鞣质的增多，煎液中酸性增强，加速了生物碱的分解。从本研究可以看出，3种双酯型生物碱溶出变化与草乌与诃子配伍比例有直接关系，一方面，诃子鞣质成分在一定量时，能够促进生物碱的溶出，也能够抑制生物碱的水解。另一方面，在诃子配伍比例较大，酸性较强时，更加快了生物碱的水解，导致水煎液中3种双酯型生物碱含量降低，与文献[11-15]鞣质抑制生物碱的溶出相悖。

通过对煎煮后药渣及沉淀中3种双酯型生物碱的检测，可以看到药渣及沉淀中3种双酯型生物碱含量较低，说明3种双酯型生物碱稳定性较差，很容易分解；进而也能够佐证在诃子较高比例配伍时，溶液中3种双酯型生物碱含量较低的原因。

草乌在蒙药应用中常用诃子进行炮制，炮制的方法是将诃子-草乌(1∶2)共煎，然后将草乌捞出，晒干入药，从这个炮制过程看，上述研究也能给出科学的解释，因为在诃子-草乌(1∶2)共煎时，诃子能够将部分双酯型生物碱溶出，所以既降低了毒性，又保证了药效，科学合理。

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Terminalia chebula combined with Aconitum kusnezoffii in different proportions compatibility to the content of three kinds of double ester type Aconitum alkaloids

ZHAO Aijuan1,LI Hong1,TU Ya2*,LI Xiao1*

(1.School of Life Science,Beijing University of Technology,Beijing 100124,China;2.China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China)

ObjectiveTo explore the principles of compatibility of attenuated,we have established the method of HPLC for determination three kinds of double ester type Aconitum alkaloids,which were determined in different proportion of Terminalia combined with Aconitum.MethodsThe HPLC method was used to determine content of the three Diester alkaloids by chromatographic conditions:ExtendC18 column (4.6 mm ×250 mm,5 μm) was used,the moving phase was ammonia and methanol-0.05% gradient elution,column temperature was set at 30℃,detection wavelength 235 nm,and the flow rate 1 mL·min-1.ResultsIt is slightly different about the change trend of the content of three kinds of double ester alkaloids after compatibility decoction of Terminalia and Aconitum in different ratios (0.5∶1,1∶1,2∶1 and 3.3∶1,5∶1).The trend of the total content of three kinds of Diester alkaloids was increased firstly and then decreased with the ratio of Myrobalam increasing,which is like a parabola,The total content in the solution was the largest when the ratio was set at 2∶1,and when the ratio was set at 5∶1,the content of three kinds of double ester type alkaloids was least,which was lower than the content of these alkaloids in the Aconitum single decoction.ConclusionAconitum and Terminalia in different proportions compatibility decoction,significantly changed three kinds of diester alkaloids content;on the one hand,it promoted the dissolution of three kinds of diester type alkaloids,on the other hand,it accelerated the hydrolysis of three kinds of alkaloids when the high compatibility proportion of Terminalia was set in Aconitum and Terminalia proportions compatibility decoction.

AconitumkusnezoffiiReichb;TerminaliachebulaRetz;compatibility;HPLC;Diester alkaloid

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.04.013

国家自然科学基金项目面上项目“基于草乌减毒效应的诃子化学成分及缓和药性特征的相关研究”(81274192)。

赵爱娟(1988-)，女，硕士研究生，主要从事中药化学成分与分析。

李霄，博士，副研究员，电话-13520468471，电子信箱-lixiao@bjut.edu.cn

R284.3

A

2095-6258(2016)04-0697-04

2016-01-04)

图雅，教授，电话-(010)64089685，电子信箱- tuya126@126.com