温经止痛凝胶膏剂体外释放度及透皮特性的研究

张锦炳　李　周　张　艳　王利胜.广东省韶关市中医院药剂科，广东韶关　506；.广州中医药大学中药学院，广州广东　50006

温经止痛凝胶膏剂体外释放度及透皮特性的研究

张锦炳1李周2张艳2王利胜2
1.广东省韶关市中医院药剂科，广东韶关512026；2.广州中医药大学中药学院，广州广东510006

目的 研究温经止痛凝胶膏剂的体外释放及透皮特性以及挥发油包合技术对挥发油透皮特性的影响，为开发温经止痛处方贴敷预防和治疗痛经的药物新型给药系统提供实验支持。方法 分别以透析膜和大鼠皮肤为屏障，以扩散池法进行体外释放和透皮实验，以方中君臣药当归、川芎的主要有效成分之一的藁本内酯为指标，利用高效液相色谱法分析，测定温经止痛凝胶膏剂释放介质和透皮接收液中的药物浓度，分别以累积释放量和透皮量对时间进行回归计算，计算12 h的累计释放率和24 h的透皮速率。结果 藁本内酯自温经止痛凝胶膏剂中体外释放的方程为Q=4.37t+1.79，r=0.993，释放速率为4.37μg/（cm2·h），12 h累计释放率为90.9%；24 h温经止痛凝胶膏剂挥发油包合组的透皮特性方程为：Q=1.45t+6.06，透皮速率为1.45μg/（cm2·h）；挥发油包合组24 h的透皮特性方程为Q=2.65t+11.99，透皮速率为2.65μg/（cm2·h）。结论 藁本内酯的释放速率远大于透皮速率，释放速率可保证其稳定透皮的动力，其透皮过程不受其释放的限制；包合技术可使藁本内酯的透皮速率降低，但是影响不大，挥发油可包合后再加入凝胶膏剂中。

温经止痛凝胶膏剂；体外释放度；透皮特性；藁本内酯

凝胶膏剂又称为巴布剂，系指药材提取物、药物与适宜的亲水基质混匀后，涂布与无纺布上制成的外用制剂，凝胶膏剂具有载药量大、贴敷性和保湿型好、无致敏与刺激性等优点。作为一种经皮给药制剂、凝胶膏剂不经过肝脏“首过作用”和胃肠道的破坏，能维持稳定持久的血药浓度并降低毒副作用，进而提高疗效，减少给药次数［1-5］。温经止痛凝胶膏剂作为一种经皮给药制剂，药物中有效成分只有从基质中释放出来并透过皮肤才能发挥药效作用，因此研究药物的释放度和透皮特性是评价经皮给药制剂的必要内容。

温经止痛凝胶膏剂处方由当归、川芎、冰片、延胡索、吴茱萸、肉桂、细辛等7味中药组成，在治疗寒凝瘀滞、气滞血瘀所致的痛经时效果显著，其中当归、川芎分别为处方的君臣药。温经止痛凝胶膏剂制备时加入的挥发油由当归、川芎、细辛、吴茱萸等中药材提取而得，为了增加挥发油的稳定性，在凝胶膏剂的制备过程中，首先对挥发油进行了包合，但挥发油包合之后可能会对其透皮特性产生一定影响［6］。为了考察温经止痛凝胶膏剂的释放度、透皮特性以及包合技术对挥发油透皮特性的影响，本研究拟以当归、川芎的主要有效成分之一的藁本内酯为指标成分［7-14］，对温经止痛凝胶膏剂的体外释放度及体外透皮特性进行考察。

1　仪器与试药

Waters高效液相色谱仪包括515泵，2487紫外检测器（美国Waters公司）；N3000色谱工作站（浙江大学）；TK12A透皮扩散仪（上海锴凯科技贸易有限公司）；KQ500型超声清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）；DLB200电子天平（日本岛津公司）。

药物干浸膏、挥发油皆为实验室自制（处方中挥发油由当归、川芎等中药材提取而得，挥发油中藁本内酯的含量为0.08 g/mL）。藁本内酯对照品（成都普菲德生物技术有限公司，批号：121204）；β-环糊精（β-CD，湖北新颖河化工有限公司）；聚丙烯酸钠（NP700，广州市升彤京海淀会精细化工厂）；甘油，丙二醇（广州化学试剂厂）；油酸（OA，广州化学试剂厂）；氮酮（Azone，天津市北联精细化学试剂厂），冰片（江西吉安市林科天然冰片厂）；色谱纯甲醇（迪马公司），水为蒸馏水，透析袋（上海金穗生物科技有限公司，MWCO：8000～14000）；其他试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1挥发油包合物的制备

取处方量的挥发油0.3mL，加0.6 mL的无水乙醇溶解；另取2.4 gβ-CD，在60℃的恒温水浴下，将β-CD搅拌溶解于其24 mL的蒸馏水中；将制好的β-CD溶解置于磁力搅拌器上，控制温度40℃，搅拌速度500 r/min，将挥发油乙醇溶液缓缓加入到β-CD溶液中，在磁力搅拌器上搅拌0.5 h后，将加入挥发油乙醇溶液的β-CD水溶液置于冰箱中静置过夜，过滤，滤渣在40℃真空干燥箱中干燥5 h后取出，置于避光阴凉处备用，滤液用封口膜封存，置于冰箱中备用，即得挥发油包合物。

2.2温经止痛凝胶膏剂的制备

取卡波姆-980 0.035 g加入1.62mL的水以及包合物滤液1.64mL中溶胀24 h，并加入药物干膏粉1 g和挥发油包合物0.19 g，作为A相；取冰片0.05 g、甘油2.0 g、NP-700 0.35 g和乙醇0.4 mL置于烧杯中，搅拌均匀，作为B相；取甘羟铝0.07 g、酒石酸0.05 g、氮酮0.2 g、丙二醇0.1 g、水0.4mL于50mL烧杯，混匀，作为C相。将C相缓缓加入到A相中，混匀，然后再加入B相，搅拌5 min，即得黏度适宜的正常对照组凝胶膏剂。

2.3藁本内酯含量测定方法的建立［15］

2.3.1色谱条件 Platisil ODS色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇-水（80∶20）；流速：1.0 mL/min；检测波长：328 nm；柱温25℃；进样量10μL。以藁本内酯色谱峰面积计算，保留时间为7.5min，理论塔板数按藁本内酯峰计应不低于5000。色谱图见图1。

绿色经济发展评价指标体系应具有实际可操作性，要考虑数据获取的难易程度以及可收集性，数据最好是统计部门在同一时段按同一口径、同一标准收集的公开资料。

2.3.2对照品贮备液的制备采用微量进样器吸取藁本内酯对照品适量，置于10 mL容量瓶中，精密称定其质量为5.04mg，用甲醇定容至刻度，摇匀即得浓度为504μg/mL的藁本内酯标准母液。

2.3.3阴性样品与供试品溶液的制备将生理盐水加入无水乙醇使两者比例为6∶4，即得空白接收液（阴性样品）；另取温经止痛凝胶膏剂体外透皮接收液，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.3.4标准曲线的绘制精密吸取标准母液0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0mL，分别置于10mL容量瓶中，定容及摇匀，即得浓度2.52、5.04、12.6、25.2、37.8、50.4μg/mL的系列标准溶液。按照“2.3.1”项下色谱条件，依次进样，进样量10μL，重复3次。取平均峰面积（Y）与浓度（X）进行直线回归分析，得回归方程为Y=17 238X-3875.4，r=0.9998。结果表明藁本内酯在质量浓度为2.52～50.4μg/mL范围内线性关系良好。

2.3.5精密度试验取质量浓度25.2μg/mL的对照品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样，连续重复进样6次，各10μL，测得藁本内酯峰面积，并计算其RSD为0.49%，表明该仪器的精密度良好。

2.3.6稳定性试验取同一供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样，测定溶液中藁本内酯的峰面积，并计算其RSD值为1.14%，表明供试品溶液在24 h内测定是稳定的。

2.3.7加样回收率试验精密量取已测藁本内酯含量的透皮吸收液6份，分别精密加入藁本内酯对照品溶液，按上述色谱条件进行测定，计算回收率。结果平均回收率为98.9%，RSD为1.38%，表明该方法准确性良好，可作为制剂的体外释放度研究的含量测定方法。

2.4体外释放度测定

图1　藁本内酯HPLC图

其中Qn：第n个时间点的累积面积透过量（μg/cm）；V：接收室中接受液的总体积（8 mL）；Vi：每次的取样体积（1 mL）；Cn：第n个取样点测得的药物质量浓度（μg/mL）；A：有效扩散面积（3.14 cm2）；m：1 g温经止痛凝胶膏剂中藁本内酯的量（200μg）。求得累积渗透量之后，将累积渗透量（Q）对时间（t）进行方程拟合，分别有下列3种方式：零级方程：Q=a t+b；一级方程：ln Q=a t+b；Higuchi方程：Q=a t1/2+b［20-21］。将累计渗透量（Q）对时间（t）用上述3种方式进行回归，求得回归方程，并求得回归系数（r），回归系数最大的方程即为最佳拟合方程，也是能说明温经止痛凝胶膏剂释药方式的最佳方程。由表1可以得知，温经止痛凝胶膏剂中藁本内酯接近零级速率方程，药物累计渗透量与时间成正比，12 h温经止痛凝胶膏剂中藁本内酯的累计释放量达到181.9μg，累计释放率达90.9%，说明温经止痛凝胶膏剂12 h的释药特性良好，温经止痛凝胶膏剂的制备工艺合理，满足经皮给药制剂的要求。实验数据及结果见表1。

2.5包合技术对挥发油体外透皮特性的影响

2.5.1离体鼠皮的制备与保存取健康小鼠，用电动剃毛机剃去小鼠腹部毛，再用6%的硫化钠溶液对剩余的毛发进行脱除，2 d后小鼠脱臼处死，小心剥离腹部皮肤，剔除皮下脂肪组织及粘连物，用生理盐水反复冲洗干净，置于-20℃冰箱中保存备用 （一周内使用完）。实验前自然解冻，每次实验前检查皮肤的完整性，不能有任何破损。

表1　温经止痛凝胶膏剂12 h累计释放量（n=3）

2.5.2离体大鼠透皮试验以藁本内酯24 h的透皮速率及累计透皮量为指标，按照“2.4”项下操作（将Franz扩散池中供给池和接收池之间的屏障换成离体鼠皮、角质层面向供给池）分别对挥发油包合组及挥发油未包合组（“2.2”项下包合物换成挥发油，包合物滤液换成同体积纯水）凝胶膏剂藁本内酯的透皮特性进行考察，从而包合技术对挥发油透皮效果的影响，从表2和表3可以看出，未包合组藁本内酯的累计透过量明显高于包合组，说明挥发油用β-环糊精包合之后，其透皮特性受到影响，透皮特性降低，但是仍然具有较好的透皮性能，但是挥发油包合之后能降低其挥发性能，较大程度地提高稳定性，因此最后选择将挥发油包合之后再加入到凝胶膏剂之中。见表2～3。

表2　挥发油包合组与未包合组24 h藁本内酯的透皮数据（n=3）

表3　挥发油包合组与未包合组Q-t方程及相应参数（n=3）

3　讨论

“2.2”项下温经止痛凝胶膏剂制备时，A相中加入了制备挥发油包合物时的滤液（制备时，挥发油加入β-CD饱和溶液中，搅拌，静置，过滤得挥发油饱和物，滤液则加入A相），是因为挥发油在采用饱和β-CD溶液包合时，未包合的挥发油溶于或分散在β-CD溶液中，若弃去此部分，将会造成挥发油的浪费，减少了处方的用量［22］。因此在计算藁本内酯的累计释放率时，温经止痛凝胶膏剂中藁本内酯的含量即按加入的挥发油中所含的藁本内酯计算。

冰片是温经止痛凝胶膏剂处方中的药物之一，为了减少损失冰片并没有和处方中其他药物一起提取制备浸膏，而是磨成极细粉之后直接加入到B相；另外冰片还有促渗剂的作用，能促进处方中其他药物成分的透皮吸收［23］，说明了处方组成的合理性。

温经止痛凝胶膏剂是将中药复方提取物直接制成的凝胶膏剂，有效成分较多，本研究仅以藁本内酯为指标成分考察其药物的释放特性，可能不能反映对全方整体的释放特性［24］，但也是一次有意义的探讨，今后将对多个代表性的指标成分进行释放度的考察。

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Study on release and permeation behavior of Wenjingzhitong Gel Paste in vitro

ZHANG Jinbing1LI Zhou2ZHANG Yan2WANG Lisheng2
1.Department of Pharmacy，Shaoguan Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Province，Shaoguan 512026，China；2.School of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong Province，Guangzhou510006，China

Objective To study the release and permeation behavior of Wenjingzhitong Gel Paste in vitro to be used in the treatment of dysmenorrehea prevention and care and to study the influence of inclusion technique to the permeation behavior of essential oil.Methods Dialysis membrane and rat skin were used as the barriers respectively.The release and permeation experiment were carried out with Franz diffusion cell in vitro.Ligustilide，the main active ingredient of the monarch drug（Angelica sinensis）and ministerial drug（Ligusticum wallichii）in the prescription，was used as a marker，and measured by high performance liquid chromatography（HPLC）method.The accumulated and permeation amount were regressed linearly to time to calculate the release and permeation rate separately.Results The release equation of ligustilide from Wenjingzhitong Gel Paste was Q=4.37t+1.79，r=0.993；the release rate was 4.37μg/（cm2·h）and the accumulated release ratio in 12 h was 90.9%.Permeation equation of Wenjingzhitong Gel Paste with inclusion technique applied to essential oil in 24 h was Q=1.45t+6.06 and the release rate was 1.45μg/（cm2·h），while permeation equation without inclusion technique was Q=2.65t+11.99 and the release rate was 2.65μg/（cm2·h）.Conclusion The release rate of ligustilide from Wenjingzhitong Gel Paste is much greater than the permeation one，which can make ligustilide permeate sustainedly.Inclusion technique makes the permeation rate decrease little，thus the essential oil can be included in the cyclodectrin first and then be added into the hydrogel patch.

Wenjingzhitong Gel Paste；Release in vitro；Permeation behavior；Ligustilide

R284.1

A

1673-7210（2016）01（c）-0035-05

2015-10-12本文编辑：赵鲁枫）

广东省广州市科技计划项目（2013J4100080）。

王利胜（1968.7-），男，博士，教授，博士生导师，主要从事药物制剂新剂型与新技术研究。