不同浓度普伐他汀对人肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响

杨付红，张春娣

(1新乡医学院，河南新乡453000；2齐齐哈尔医学院)



不同浓度普伐他汀对人肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响

杨付红1，张春娣2

(1新乡医学院，河南新乡453000；2齐齐哈尔医学院)

目的观察不同浓度普伐他汀对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响。方法取A549细胞分为4组，分别加入含20、40、80、160 μmol/L普伐他汀的培养液，采用MTT法观察各组培养24、48、72 h时细胞增殖情况。取A549细胞分为3组，分别加入含普伐他汀40、80、160 μmol/L的培养液；另设空白对照组，仅加入培养液；培养48 h后，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，Western blot法检测各组Bax、Bcl-2蛋白表达。结果相同时间点不同浓度普伐他汀对A549细胞的增殖抑制率随浓度升高逐渐升高(P均<0.05)；20、40、80、160 μmol/L普伐他汀作用48、72 h时的细胞增殖抑制率均高于同浓度作用24 h时(P均<0.05)。40、80、160 μmol/L普伐他汀作用48 h时的细胞凋亡率较空白对照组明显升高(P均<0.05)，且随浓度增加，凋亡率逐渐升高(P均<0.05)。随着普伐他汀浓度增加，A549细胞Bax表达逐渐升高，Bcl-2表达逐渐降低(P均<0.05)。结论普伐他汀对人肺腺癌A549细胞具有抑制增殖和促进凋亡的作用，且随浓度增加作用不断增强；其机制可能与上调Bax表达、下调Bcl-2表达有关。

普伐他汀；肺腺癌；细胞增殖；细胞凋亡；Bax；Bcl-2

目前我国肺腺癌的发病率不断增加，已成为肺癌最常见的病理类型[1]。他汀类是胆固醇合成的限速酶-羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的竞争性抑制剂，可通过降低HMG-CoA还原酶活性，降低细胞内胆固醇的合成及阻滞羟甲基戊酸(MVA)途径，从而抑制多种肿瘤细胞增殖，诱导分化和凋亡[2，3]。最新研究显示，他汀类药物可通过抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制血管生成、预防肿瘤转移等发挥抗肿瘤作用[4～6]。2015年1～12月，我们观察了不同浓度普伐他汀对人肺腺癌A549细胞的增殖抑制和促凋亡作用，及其对细胞凋亡调节蛋白Bax、Bcl-2的影响，探讨其抗肿瘤作用机制。

1　材料与方法

1.1材料人肺腺癌A549细胞株购自美国模式培养物集存库。普伐他汀(美国Sigma公司)固体粉末50 mg，用双蒸水配制成10 mmol/L的母液，在超净工作台内用0.22 μm微孔滤器过滤除菌、分装，-20 ℃避光保存，实验时根据需要加入培养基稀释。MTT(美国Sigma公司)，Bax、Bcl-2一抗(武汉三鹰生物技术有限公司)，RIPA细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、预染蛋白质Marker、AV-PI凋亡试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)；CO2培养箱(美国Thermo公司)；酶标仪(Labsystem MK3，芬兰)；流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2细胞培养将A549细胞置于含10%胎牛血清及青、链霉素各100 μg/mL的F12培养基中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞长满至培养瓶底的90%左右时，用0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化液消化、传代培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.3细胞增殖能力观察采用MTT法。取对数生长期细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×104/mL，接种于96孔培养板。将细胞分为普伐他汀20、40、80、160 μmol/L组，每组设5个复孔，37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。分别加入含20、40、80、160 μmol/L普伐他汀的培养液，继续培养24、48、72 h。另设空白对照组，仅加入培养液。每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，继续培养4 h，吸去孔内培养基，每孔加入二甲基亚砜150 μL，振荡均匀，用酶标仪在490 nm波长处测定各孔光密度(OD)值。细胞增殖抑制率=(1-观察孔OD值/对照孔OD值)×100%。

1.4细胞凋亡检测采用PI染色法。取对数生长期细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×105/mL，接种于6孔板。将细胞分为普伐他汀40、80、160 μmol/L组，每组设3个复孔。待细胞完全贴壁后，分别加入含普伐他汀40、80、160 μmol/L的培养液。另设空白对照组，仅加入培养液。培养48 h后，常规消化，离心弃上清，PBS重悬细胞。再次离心，收集细胞，加入PBS重悬细胞。离心，弃PBS，加入适量Binding Buffer重悬细胞。加入5 μL AnnexinⅤ-FITC溶液和10 μL PI染料，混匀，室温避光反应15 min，上流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.5细胞内Bax、Bcl-2蛋白检测采用Western blot法。取对数生长期细胞，按1.4方法进行分组、培养。48 h后加入PBS制成单细胞悬液，离心，加入蛋白裂解液提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白含量。取蛋白行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至NC膜上，5%脱脂奶粉室温封闭过夜，加入一抗Bax、Bcl-2和GAPDH内参抗体，TBST洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下反应2 h，TBST洗膜，进行化学发光、显影。以目的条带与内参GAPDH条带的OD比值表示目的蛋白的相对表达量。

2　结果

2.1各组细胞增殖抑制率比较相同时间点普伐他汀对A549细胞的增殖抑制率随浓度升高而明显升高；各浓度48、72 h时的细胞增殖抑制率均高于同浓度作用24 h时(P均<0.05)。见表1。

表1　各组细胞增殖抑制率比较±s)

注：与20 μmol/L组比较，*P<0.05；与40 μmol/L组比较，△P<0.05；与80 μmol/L组比较，▲P<0.05；与同一浓度24 h时比较，#P<0.05。

2.2各组细胞凋亡率比较40、80、160 μmol/L组及空白对照组的细胞凋亡率分别为4.270%±0.272%、8.423%±0.096%、12.440%±0.492%、1.380%±0.255%，普伐他汀各浓度组均高于空白对照组，80、160 μmol/L组高于40 μmol/L组，160 μmol/L组高于80 μmol/L组(P均<0.05)。

2.3各组细胞Bax、Bcl-2蛋白表达比较随普伐他汀浓度升高，Bax蛋白表达逐渐升高，Bcl-2蛋白表达逐渐降低(P均<0.05)。见表2。

表2　各组细胞Bax、Bcl-2蛋白表达比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与40 μmol/L组比较，#P<0.05；与80 μmol/L组比较，△P<0.05。

3　讨论

细胞凋亡是受基因调控的精确过程，通过细胞膜上的死亡受体激活Caspase-3导致细胞凋亡，或通过胞质内线粒体中细胞色素C释放激活Caspase-9，进而活化Caspase-3促进凋亡[7]。肿瘤细胞不受控制的异常增殖或细胞凋亡受到过度抑制，打破了细胞增殖与细胞凋亡的平衡关系，进而诱发或促进各种癌基因或相关信号途径，导致肿瘤的发生发展。

恶性肿瘤细胞的凋亡抑制往往造成肿瘤细胞生长失控，因此促进细胞凋亡是抗肿瘤的重要途径。细胞凋亡的重要调节因子Bcl-2家族包括抗凋亡基因和促凋亡基因，其中Bcl-2可抑制各种刺激下多种细胞的凋亡，而Bax是重要的促细胞凋亡基因之一[8，9]。Bax可对抗Bcl-2的抗凋亡作用，又可以与Bcl-2形成异源二聚体Bcl-2/Bax，也可以与自身形成同源二聚体Bax/Bax，从而调节细胞凋亡。Bcl-2与Bax的比例在细胞凋亡中起关键作用，在正常情况下二者比值相对稳定，而在凋亡信号的刺激下，Bcl-2表达下调，Bax表达上调，促进细胞凋亡。

他汀类药物是一种有效地降低血清胆固醇药物，具有除降脂作用外的多种功效，如减少心血管事件、抗炎、心肌保护等作用[10，11]。研究证实，他汀类药物还可通过抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制血管生成、预防肿瘤转移等发挥抗肿瘤作用。还有研究认为，他汀类能够诱导肺癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞凋亡[12]，对正常细胞没有显著毒性作用，具有良好的应用前景。本研究结果显示，20、40、80、160 μmol/L普伐他汀对人肺腺癌A549细胞的增殖抑制率随浓度升高、作用时间延长而明显升高；40、80、160 μmol/L普伐他汀作用48 h时的细胞凋亡率较空白对照组明显升高；随普伐他汀浓度增加，A549细胞Bax蛋白表达逐渐升高，Bcl-2蛋白表达逐渐降低。提示普伐他汀可通过抑制A549细胞增殖、促进其凋亡过程中Bcl-2家族的作用来抑制肿瘤细胞的发生发展，而肿瘤细胞凋亡则是治疗肿瘤的主要手段之一[13]。

综上所述，普伐他汀可诱导A549细胞凋亡，其作用随普伐他汀浓度升高和作用时间延长而增强，在此过程中还伴有Bax蛋白表达增加和Bcl-2蛋白表达下降，证实普伐他汀可以呈浓度依赖性地促进A549细胞凋亡，其作用机制可能与下调Bcl-2蛋白表达及上调Bax蛋白表达有关。

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新乡医学院研究生创新课题计划基金(YJSCX20439Y)；齐齐哈尔医学院博士基金(QY2015B-02)。

张春娣(E-mail: 260921464@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.22.012

R734.2

A

1002-266X(2016)22-0036-03

2015-12-02)