Bcl-2与自噬的研究进展*

倪振洪，何凤田，连继勤（第三军医大学生物化学与分子生物学教研室，重庆400038）

·专家笔谈·

Bcl-2与自噬的研究进展*

倪振洪，何凤田，连继勤△（第三军医大学生物化学与分子生物学教研室，重庆400038）

2003年7月获生物化学与分子生物学博士学位，2008年10月至2010年8月留学于美国密歇根大学医学院放射肿瘤学系。主要研究方向为细胞自噬与肿瘤，先后主持国家及省部级科研课题8项，以第一和通讯作者发表SCI论文12篇，总影响因子56.03分，单篇最高影响因子11.753，被引用次数263次，以第一发明人申请获得国家发明专利1项。

基因，Bcl-2；基因，p53；自噬；综述

B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）是一种含有多个BH结构域的抗凋亡蛋白。最近研究表明，Bcl-2蛋白还与细胞的自噬过程密切相关，与自噬信号途径中的多个分子进行相互调节，发挥抗自噬的作用。本文综述了Bcl-2与自噬关系的相关研究进展。

图1　Bcl-2抗凋亡蛋白家族成员［1］

1　Bcl-2及其家族蛋白

Bcl-2家族蛋白是目前研究得最深入、最广泛的调控线粒体途径凋亡的一类分子，在线虫、病毒和哺乳动物中已发现超过20个Bcl-2家族成员，同源性较高。家族成员分为3类：（1）含有BH1、BH2、BH3、BH4 4个高度保守结构域的抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-w 和A1；（2）含有BH1、BH2、BH3、BH4 4个高度保守结构域的促凋亡蛋白，包括Bak和Bax；（3）只含有BH3结构域的BH3样蛋白，包括Bim、Bid、Puma、Noxa、Bad、Hrk、Bmf、bik。见图1。Bcl-2家族抗凋亡蛋白的BH1～BH4结构域在空间上形成1个疏水凹槽，这一结构可以与含BH3结构域的促凋亡蛋白及 BH3样蛋白 Bak、Bax、Bad、Noxa等特异地结合，通过阻止线粒体外膜通透化（mitochondria outer membrane permeabilization，MOMP）从而使肿瘤细胞逃避凋亡，是造成肿瘤治疗抵抗的重要原因［1］。

Bcl-2家族蛋白中最先被发现的是 Bcl-2。Tsujimoto等［2-3］于1985年在研究克隆滤泡性非何杰金B细胞淋巴瘤最常见的转位t（14；18）过程中发现。Bcl-2基因通过转移并置于14号染色体长臂的32区导致转录增强从而过度表达。Bcl-2的基因结构含有3个外显子和2个内含子，其编码蛋白含239个氨基酸残基，相对分子质量约为26×103。Bcl-2蛋白在细胞内主要分布于线粒体膜、核膜和内质网膜。已有研究表明，在人类的多种肿瘤组织和细胞中存在Bcl-2的过表达，这种表达与肿瘤的发生、发展及治疗抵抗密切相关［4］。Bcl-2是目前研究最为深入的抗凋亡蛋白之一，能通过与促凋亡蛋白的结合，抑制促凋亡蛋白的寡聚及随后的MOMP发生进而阻断线粒体途径的凋亡；此外，Bcl-2还能通过调节细胞内的钙离子信号通路和氧化应激水平等发挥抗凋亡作用［4-5］。近年来，研究发现Bcl-2除了调控凋亡外，还能调控细胞自噬，为Bcl-2的功能开拓了新的视野。

2　自　噬

细胞自噬（autophagy）是一个高度保守的代谢过程，通过对细胞内物质（受损细胞器、衰老细胞器、不需要的大分子及入侵病原体）的降解，释放出供细胞重新合成所需的氨基酸、核苷酸、脂肪酸等小分子物质及能量以维持细胞的稳态。营养不足、缺氧、感染等都可以诱导细胞自噬［6-7］。细胞自噬开始时，由双层膜包裹着待降解的物质形成自噬小泡（autophagosome），随后与溶酶体融合，形成自噬溶酶体（autolysosome），在溶酶体水解酶的作用下将包裹的物质降解（图2）。根据底物进入溶酶体的途径不同可将自噬分为3类：微自噬、巨自噬和分子伴侣介导的自噬。细胞自噬一方面可以通过为营养物质的重新合成提供原料和能量来维持细胞稳态，有利于细胞的生存；另一方面，过度的细胞自噬将导致细胞的死亡。在饥饿等多种情况刺激下，细胞的mTOR丝氨酸/苏氨酸激酶受到抑制，从而使下游的AGT13去磷酸化后与ATG1激酶和ATG17结合，进而启动自噬。在自噬成膜的起始阶段，由哺乳动物自噬基因Beclin1等自噬相关的蛋白组成的复合体至关重要，包括Beclin1（the mammalian orthologue of ATG6），UVRAG（UV irradiation resistance-associated tumour suppressor gene），Vps15（a myristylated kinase）和HMGB1（highmobility group box 1）等。在自噬膜的延伸阶段，有2种泛素样连接系统参与。一种是在E1样酶ATG7和E2样酶ATG10的作用下形成的ATG5-ATG12复合体；另一种是ATG4、ATG7和ATG3等作用下LC3前体转化为酯化的LC3Ⅱ进而连接在自噬体膜上。自噬是一个多基因参与的复杂的细胞调控过程，任何一个环节出现障碍都会影响自噬的功效［6］。目前研究发现，细胞自噬几乎参与了心血管疾病、神经系统疾病、肿瘤、炎症和衰老等多种生理病理过程，深入研究自噬的发生和调控机制，有助于为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法［7］。

图2　细胞自噬的过程［6］

3　Bcl-2与自噬

Bcl-2作为经典的抗凋亡蛋白，近来研究发现其在调控细胞自噬的过程中也有重要作用。其蛋白的三维空间结构形成的疏水凹槽除了能结合含有BH3结构域的促凋亡蛋白，也能与自噬相关蛋白结合，从而影响细胞自噬。此外，Bcl-2还能通过多种机制调控氧化应激，而氧化应激在诱导自噬和凋亡中均发挥了作用。因此，深入研究以Bcl-2为中心的抗凋亡和抗自噬调控网络有助于靶向药物的开发和临床用药选择。

3.1Bcl-2与Beclin1Beclin1是与酵母Apg6/Vps30基因同源的哺乳动物自噬基因。基因Beclin1位于人染色17q21，编码相对分子质量为60×103的蛋白质。Beclin1在自噬的启动过程中十分重要，Beclin 1缺陷的小鼠中自噬是不能被激活的。采用siRNA干扰技术下调Beclin1的蛋白水平以后，多种处理因素对自噬的诱导作用均被明显抑制［8-10］。研究发现Bcl-2及家族成员Bcl-xl能通过疏水凹槽与Beclin1结合，从而抑制Beclin1及其复合体诱导自噬的功能（图3）。多种BH3模拟化合物能通过竞争BH3结构域而打断Bcl-2/xl与Beclin1的相互作用诱导自噬的发生［10］。在饥饿条件下，c-Jun氨基末端激酶1（JNK1）的激活能造成Bcl-2的磷酸化，导致Bcl-2与Beclin1的分离及自噬的激活［11］。在心肌母细胞，JNK1的激活可以打断Bcl-2/Beclin1之间的相互作用，从而促进了细胞自噬发生，抵抗了心肌细胞凋亡［12］。Strappazzon等［13］发现在正常情况下，一种能与Beclin1结合正向调控自噬的蛋白（AMBRA1）与线粒体上的Bcl-2结合，而不与Beclin1结合，当受到自噬启动信号后，AMBRA1与Bcl-2分离并进而与Bcelin1结合，促进自噬发生。此外，具有E3泛素蛋白连接酶活性的Parkin蛋白能够通过其C端与Bcl-2直接结合，介导Bcl-2的单链泛素化，增强Bcl-2的稳定性；过表达Parkin蛋白能显著增强Bcl-2与Beclin1的相互作用进而抑制自噬［14］。但也有研究发现，在某些细胞系干扰Beclin1后，Bcl-2抑制剂还是能够诱导自噬，表明Bcl-2介导的自噬抑制可能有非依赖Beclin1的途径［15-16］。

图3　Bcl-2通过Beclin1调控细胞自噬［17］

3.2Bcl-2与ATG5/ATG12自噬相关基因5（autophagy-related gene 5，ATG5），是自噬小体膜的重要组成部分。通过ATG5-ATG12复合体的形成，自噬小体得以延伸。缺乏ATG5的小鼠或细胞中，自噬很难被诱导。最近研究发现ATG5除了参与自噬外，还能通过调控线粒体上的Bcl-2家族成员Bcl-xl诱导细胞凋亡的发生［18］。有研究发现过表达ATG5的细胞对多种死亡诱导因素起到了增敏作用，而下调ATG5的表达则出现了部分药物抵抗；进一步研究发现在多种凋亡刺激的情况下，ATG5的氨基酸末端可以被钙蛋白酶calpain切去一部分变成剪切的ATG5，剪切的ATG5可以与线粒体上的Bcl-xl结合从而使促凋亡蛋白解离后寡聚，促进细胞凋亡发生；Bcl-2的表达可以阻止剪切的ATG5的促凋亡作用。在乳腺癌MCF-7细胞系，干扰Bcl-2的表达能诱导ATG5依赖的细胞自噬发生［19］，Rubinstein等［20］研究发现自噬小体延伸过程中的另一个重要分子ATG12能通过其BH3样的结构域与Bcl-2和Mcl-1结合，抑制其抗凋亡功能从而促进了细胞死亡。

3.3Bcl-2与ROSROS在诱导细胞凋亡过程中的作用已得到普遍认同，近年来研究发现ROS也能调控细胞自噬［21］。ATG4B是哺乳动物自噬发生过程中的关键酶，其酶活性中心含有受ROS调控的位点，ROS能通过影响ATG4B的活性调节细胞自噬［22］。此外，ROS还能通过调节多种磷酸激酶的活性来影响自噬的发生。从点地梅中提取的具有抗瘤特性的Saxifragifolin D能够通过ROS诱导内质网应激进而激活JNK，激活的JNK能使Bcl-2磷酸化后与Beclin1解离，导致自噬的发生［23］。从皮层根提取的二氯甲烷可以激活ROS依赖的保护性细胞自噬［24］。当ROS造成基因组损失的时候，p53作为转录因子可以促进下游多个靶基因的表达，进而通过Sestrin1 和Sestrin2抑制mTORC1的活性，启动自噬［25］。Bcl-2家族抗凋亡蛋白在调控ROS中具有重要作用［26］。研究发现采用过表达技术上调细胞中Bcl-2的蛋白水平模拟了过表达SOD的作用，显著降低了细胞内的ROS水平，阻止了氧化应激对细胞的损伤，发挥了抗氧化的作用。Bcl-2与线粒体ROS的调控密切相关，定位于线粒体的Bcl-2能够与GSH结合，清除线粒体氧化呼吸链上漏出的超氧阴离子等ROS；也有研究发现Bcl-2能够影响细胞色素C氧化酶Ⅳ（COXⅣ）的活性进而影响电子呼吸链的功能及线粒体超氧阴离子的水平［26］。Ranjan等［27］研究发现在HEK293T细胞使用HA14-1抑制Bcl-2家族抗凋亡蛋白能诱导ROS依赖的细胞自噬发生。除了BH3结构域外，Bcl-2介导的ROS变化在调控自噬和凋亡中的双重作用也是一个有趣的研究点。

3.4Bcl-2与钙离子细胞内的钙离子作为一种重要的第二信使，在信号传导中发挥着重要作用［28-30］。内质网上的Bcl-2能够调控细胞内钙离子的稳态，其能通过BH4结构域与细胞内钙库受体三磷酸肌醇受体（inositol 1，4，5-trisphosphate receptor，IP3R）相互作用抑制钙离子向胞质的释放［31］；靶向BH4结构域的小肽能通过打断Bcl-2/IP3R之间的相互作用，促进钙离子的释放，并进一步诱导凋亡。有研究发现，压力应激下内质网钙离子的释放不仅能诱导细胞凋亡，还能导致细胞自噬。维生素D3、伊屋诺霉素和毒胡萝卜内酯等能够通过调控钙离子的释放诱导Beclin1和ATG7依赖的细胞自噬发生，而定位于内质网上的Bcl-2能通过阻断钙离子的释放而抑制自噬［32-33］。

4　小结与展望

Bcl-2作为一种既能拮抗凋亡又能拮抗自噬的蛋白，其双重的调控作用决定了其信号调节通路的复杂性。抑制Bcl-2导致的自噬和凋亡变化的先后顺序及最终对细胞死亡的影响也成为了近几年的研究热点［33-36］。细胞自噬是与细胞死亡密切相关的应激反应过程，一方面能促进细胞在压力状态下的存活，一方面也能过度吞噬细胞内重要的细胞器和蛋白导致细胞死亡。因此，深入研究Bcl-2抑制剂调控自噬的机制，不仅有助于从理论水平解析Bcl-2与自噬的相互关系，寻找新的药物靶点，同时也有助于克服潜在的治疗抵抗问题，为临床中选择合适的药物联用方案提供参考。目前，以Bcl-2为靶点开发的抑制剂已有不少进入了临床前期实验，包括GX15-070，AT-101，ABT-263等［1］，在不同肿瘤细胞中均呈现了潜在的抗瘤效应，但也出现了一定的药物不敏感问题。相信随着对Bcl-2及家族成员的深入研究，以其为基础的更多药物或联用方案将造福于肿瘤患者。

［1］Lessene G，Czabotar PE，Colman PM.BCL-2 family antagonists for cancer therapy［J］.Nat Rev Drug Discov，2008，7（12）：989-1000.

［2］Tsujimoto Y，Cossman J，Jaffe E，et al.Involvement of the bcl-2 gene in human follicular lymphoma［J］.Science，1985，228（4706）：1440-1443.

［3］Tsujimoto Y，Jaffe E，Cossman J，et al.Clustering of breakpoints on chromosome 11 in human B-cell neoplasms with the t（11；14）chromosome translocation［J］.Nature，1985，315（6017）：340-343.

［4］Bettaieb A，Dubrez-Daloz L，Launay S，et al.Bcl-2 proteins：targets and tools for chemosensitisation of tumor cells［J］.Curr Med Chem Anticancer Agents，2003，3（4）：307-318.

［5］ Adams JM，Suzanne C.Bcl-2-regulated apoptosis：mechanism and therapeutic potential［J］.Curr Opin Immunol，2007，19（5）：488-496.

［6］Chiara MM，Einat Z，Adi K，et al.Self-eating and self-killing：crosstalk between autophagy and apoptosis［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8（9）：741-752.

［7］ Mijaljica D，Prescott M，Devenish RJ.Autophagy in disease［J］.Methods Mol Biol，2010，648：79-92.

［8］Tiollais P，Li TP.Hepatitis B virus X protein sensitizes cells to starvationinduced autophagy via up-regulation of beclin 1 expression［J］.Hepatology，2009，49（1）：60-71.

［9］Nirmala H，Peiyong Z，Junichi S.Oxidative stress stimulates autophagic flux during ischemia/reperfusion［J］.Antioxid Redox Signal，2011，14（11）：2179-2190.

［10］Kang R，Zeh HJ，Lotze MT，et al.The Beclin 1 network regulates autophagy and apoptosis［J］.Cell Death Differ，2011，18（4）：571-580.

［11］Wei Y，Pattingre S，Sinha S，et al.JNK1-mediated phosphorylation of Bcl-2 regulates starvation-induced autophagy［J］.Mol Cell，2008，30（6）：678-688.

［12］Chaoyong H，Huaiping Z，Hongliang L，et al.Dissociation of Bcl-2-Beclin1 complex by activated AMPK enhances cardiac autophagy and protects against cardiomyocyte apoptosis in diabetes［J］.Diabetes，2012，62（4）：1270-1281.

［13］Strappazzon F，Vietri-Rudan M，Campello S，et al.Mitochondrial BCL-2 inhibits AMBRA1-induced autophagy［J］.EMBO J，2011，30（7）：1195-1208.

［14］Dong C，Feng G，Bin L，et al.Parkin mono-ubiquitinates Bcl-2 and regulates autophagy［J］.J Biol Chem，2010，285（49）：38214-38223.

［15］Songhai T，Jian L，Jian JZ，et al.Beclin 1-independent autophagy induced by a Bcl-XL/Bcl-2 targeting compound，Z18［J］.Autophagy，2010，6（8）：1032-1041.

［16］Ping G，Chantal B，Sylvie S，et al.The Bcl-2 homology domain 3 mimetic gossypol induces both Beclin 1-dependent and Beclin 1-independent cytoprotective autophagy in cancer cells［J］.J Biol Chem，2010，285（33）：25570-25581.

［17］Levine B，Sinha S，Kroemer G.Bcl-2 family members：dual regulators of apoptosis and autophagy［J］.Autophagy，2008，4（5）：600-606.

［18］Shida Y，Remo P，Inès S，et al.Calpain-mediated cleavage of Atg5 switches autophagy to apoptosis［J］.Nature Cell Biol，2006，8（10）：1124-1132.

［19］Akar U，Chaves-Reyez A，Barria M，et al.Silencing of Bcl-2 expression by small interfering RNA induces autophagic cell death in MCF-7 breast cancer cells［J］.Autophagy，2008，4（5）：669-679.

［20］Rubinstein AD，Eisenstein M，Ber Y，et al.The autophagy protein Atg12 associates with antiapoptotic Bcl-2 family members to promote mitochondrial apoptosis［J］.Mol Cell，2011，44（5）：698-709.

［21］Li L，Ishdorj G，Gibson SB，et al.Reactive oxygen species regulation of autophagy in cancer：implications for cancer treatment［J］.Free Radic Biol Med，2012，53（7）：1399-1410.

［22］Scherz-Shouval R，Shvets E，Fass E，et al.Reactive oxygen species are essentialforautophagyandspecificallyregulatetheactivity of Atg4［J］.EMBOJ，2007，26（7）：1749-1760.

［23］Shi JM，Bai LL，Zhang DM，et al.Saxifragifolin D induces the interplay between apoptosis and autophagy in breast cancer cells through ROS-dependent endoplasmic reticulum stress［J］.Biochem Pharmacol，2013，85（7）：913-926.

［24］Park SH，Chi GY，Eom HS，et al.Role of autophagy in apoptosis induction by methylene chloride extracts of Mori cortex in NCI-H460 human lung carcinoma cells［J］.Int J Oncol，2012，40（6）：1929-1940.

［25］BudanovA，Karin M.p53 target genes sestrin1 and sestrin2 connect genotoxic stress and mTOR signaling［J］.Cell，2008，134（3）：451-460.

［26］Voehringer DW，Meyn RE.Redox aspects of Bcl-2 function［J］.Antioxid Redox Signal，2000，2（3）：537-550.

［27］Ranjan K，Sharma A，Surolia A，et al.Regulation of HA14-1 mediated oxidative stress，toxic response，and autophagy by curcumin to enhance apoptotic activity in human embryonic kidney cells［J］.Biofactors，2013，40（1）：157.

［28］Li G，Mongillo M，Chin KT，et al.Role of ERO1-alpha-mediated stimulation of inositol 1，4，5-triphosphate receptor activity in endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis［J］.J Cell Biol，2009，186（6）：783-792.

［29］Høyer-HansenM，Bastholm L，MathiasenIS，etal.VitaminD analogEB1089 triggers dramatic lysosomal changes and Beclin 1-mediated autophagic cell death［J］.Cell Death Differ，2005，12（10）：1297-1309.

［30］Lee T，Krishnamurthy M，Shinya K，et al.Intracellular calcium release is required for caspase-3 and-9 activation［J］.Cell Biochem Funct，2004，22 （1）：35-40.

［31］Pinton P，Rizzuto R.Bcl-2 and Ca2+homeostasis in the endoplasmic reticulum［J］.Cell Death Differ，2006，13（8）：1409-1418.

［32］Hoyer-Hansen M，Bastholm L，Szyniarowski P，et al.Control of macroautophagy by calcium，calmodulin-dependent kinase kinase-beta，and Bcl-2［J］. Mol Cell，2007，25（2）：193-205.

［33］Swerdlow S，Distelhorst CW.Bcl-2-regulated calcium signals as common mediators of both apoptosis and autophagy［J］.Dev Cell，2007，12（2）：178-179.

［34］Sarah S，Karen MC，Yiping R，et al.Apoptosis inhibition by Bcl-2 gives way to autophagy in glucocorticoid-treated lymphocytes［J］.Autophagy，2008，4（5）：612-620.

［35］Zhou F，Yang Y，Xing D.Bcl-2 and Bcl-xL play important roles in the crosstalk between autophagy and apoptosis［J］.FEBS J，2011，278（3）：403-413.

［36］Yongjie W，Sangita S，Beth L.Dual role of JNK1-mediated phosphorylation of Bcl-2 in autophagy and apoptosis regulation［J］.Autophagy，2008，4（7）：949-951.

连继勤，男，1974年生，现任第三军医大学生物化学与分子生物学教研室副主任，副教授，硕士研究生导师。现任中国生物化学与分子生物学会医学生物化学与分子生物学分会青年委员，中国生物化学与分子生物学会教学委员分会青年委员，重庆市生物化学与分子生物学会副秘书长，《第三军医大学学报》、《现代医药卫生》等杂志编委。

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.03.001

A

1009-5519（2016）03-0321-04

国家自然科学基金（81572375，31501061）；重庆市自然科学基金项目（cstc2014jcyjA10110）。△

，E-mail：lianjiqin@sina.com。

（2015-12-20）