不同提取溶剂对银杏叶药材中多种成分含量的影响

王兆华，纪义波，张大军

(1.吉林省中医药科学院，吉林 长春 130012；2.吉林省医疗器械研究所，吉林 长春 130062)

不同提取溶剂对银杏叶药材中多种成分含量的影响

王兆华1，纪义波2，张大军1

(1.吉林省中医药科学院，吉林 长春 130012；2.吉林省医疗器械研究所，吉林 长春 130062)

目的 ：研究水、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇五种提取溶剂对银杏叶药材中总黄酮醇苷、萜类内脂及总银杏酸含量的影响，为银杏叶的合理使用提供依据。方法： HPLC条件：总黄酮醇苷检测采用Shim-pack C18色谱柱 (150mm×4.6mm，5μm)，甲醇 - 0.4%磷酸溶液(50:50)为流动相，检测波长为360nm；萜类内脂检测采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，甲醇-四氢呋喃-水(25:10:65)为流动相，蒸发光散射检测器，漂移管温度105℃，载气流速2.8L/min；总银杏酸检测采用Shim-pack C18色谱柱 (150mm×4.6mm，5μm)，甲醇 - 1%冰醋酸溶液(90:10)为流动相，检测波长为310nm。结果： 槲皮素、山奈素、异鼠李素分别在0.0576～0.576μg、0.05672～0.5672μg、0.04128～0.4128μg范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系；银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯分别在 2.442 ～ 20.35μg、 2.109 ～17.575μg 、1.803 ～ 15.025μg、1.992 ～ 16.60μg 范围内，进样量的对数与峰面积的对数呈良好线性关系；白果新酸在0.2008～2.008μg范围内，进样量与峰面积呈良好的线性关系；水、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇回流提取制备的供试品溶液中总黄酮醇苷的含量分别为2.06，2.85，3.20，3.50，2.97 mg/20mL；萜类内脂的含量分别为0，1.04，1.25，1.57，2.08 mg/20mL；总银杏酸的含量分别为0，7.95，10.20，11.61，12.13 mg /20mL。结论： 不同提取溶剂制备的供试品溶液中三种成分的含量差别很大，民间以泡茶的方式服用银杏叶是合理的，切不可泡酒服用。

银杏叶；总黄酮醇苷；萜类内脂；总银杏酸；高效液相色谱

银杏树(Ginkgo biloba L.)[1]又名白果树，被誉为地球的"长寿树。其叶、果实、种子均有较高的药用价值，银杏叶中的黄酮类及萜类内酯化合物为有效成分。现代药理学研究表明，银杏叶提取物具有抗血小板活化因子、抗脑缺血、降血脂、抗氧化、改善心脑血管循环等多种作用，是预防治疗老年痴呆的理想饮品[2]，民间多以其泡茶或泡酒饮用。银杏叶的银杏酚酸，却是引起临床不良反应的主要物质，因此银杏酸的限量是评价银杏叶制剂质量的关键指标之一[3]。为能给银杏叶的合理使用提供依据，故对不同提取溶剂对银杏叶药材中总黄酮醇苷、萜类内脂及总银杏酸[4]含量进行了测定。

1 仪器和试药

1.1 仪器

LC-20AB高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Alltech Grace ELSD 3300检测器；LC - 10 AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；SPD- 10A紫外检测器(日本岛津公司)；KQ-250型超声波处理器(天津奥特赛恩斯仪器公司)，AE163电子天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 试药

槲皮素(批号100081-200406，供含量测定用)、山奈素(批号110861-200808，供含量测定用)、异鼠李素(批号110860-200406，供含量测定用)；银杏内酯 A(批号110862-200608，供含量测定用)、银杏内酯 B(批号110863-200508，供含量测定用)、银杏内酯 C(批号110864-200906，供含量测定用)，白果内酯(批号110865-200606，供含量测定用)；白果新酸(批号111690-200702，供含量测定用)，总银杏酸(111594-201304，供限量检查定位)均购自中国食品药品检定研究院；银杏叶药材购自江苏徐州，经本院生药室鉴定为Ginkgo biloba L.的干燥叶；甲醇为色谱纯；水为娃哈哈纯净水；四氢呋喃、乙酸、磷酸、石油醚等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品溶液制备

取银杏叶药材50g，多份，分别加水、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇500mL，提取2次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液定容至1000mL，即得样品溶液。

2.2 总黄酮醇苷含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Shim-pack C18(150mm×4.6mm，5μm；流动相：甲醇 - 0.4%磷酸溶液(50:50)；流速：1mL·min-1；检测波长：360nm。

2.2.2 对照品溶液制备

精密称取槲皮素对照品、山奈素对照品、异鼠李素对照品适量，加甲醇制成每1mL各含28.80μg、28.36μg、20.64μg的混合溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液制备与测定

取2.1项下的5个样品溶液各10mL，分别以甲醇稀释并定容至25mL，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。分别吸取供试品溶液及2.2.2项下对照品溶液各10μL，按2.2.1项下的色谱条件进行测定，计算总黄酮醇苷含量。不同提取溶剂中总黄酮醇苷含量测定结果见表1，液相色谱图见图1。

A-黄酮醇苷对照品；B-银杏叶；C-萜类内脂对照品；D-银杏叶；E-白果新酸对照品；F-总银杏酸对照品；G-银杏叶；1-槲皮素；2-山奈素；3-异鼠李素；4-白果内酯；5-银杏内酯C；6-银杏内酯A；7-银杏内酯B；8-白果新酸；9.10.11-总银杏酸

图1 HPLC图

2.2.4 线性关系考察

精密吸取2.2.2项下对照品溶液2，4，8，12，16，20μL，注入液相色谱仪，测定峰面积积分值。以进样量(C)为纵坐标，以峰面积积分值(A)为横坐标，进行线性回归。分别得回归方程为：槲皮素：Y=1705815.194X+2063.504(r=0.9991)；山奈素：Y=1930920.7X-3040.110(r=0.9996)；异鼠李素：Y=1893976.496X+ 5732.49(r=0.9997)。结果表明槲皮素、山奈素和异鼠李素分别在0.0576～0.576μg，0.05672～0.5672μg，0.04128～0.4128μg范围内，进样量与峰面积成良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验

吸取2.2.2项下对照品溶液10μL，连续进样6次，槲皮素峰面积RSD=0.85%，山奈素峰面积RSD=0.95%，异鼠李素峰面积RSD=0.98%，表明仪器精密度良好。

2.3 萜类内酯含量测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-四氢呋喃-水(25:10:65)；流速：1mL·min-1；蒸发光散射检测器，漂移管温度105℃，载气流速2.8L/min。

2.3.2 对照品溶液制备

精密称取银杏内酯A对照品、银杏内酯B对照品、银杏内酯C对照品、白果内酯对照品适量，加50%甲醇制成每1mL各含0.814mg、0.704mg、0.601mg、0.664mg的混合溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液制备与测定

取2.1项下的5个样品溶液各30mL，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10mL，静置后，精密量取上清液5mL，加入酸性氧化铝柱(200～300目，3g，内径为1cm)上，用甲醇25mL洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣以甲醇溶解并定容至10mL，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。吸取供试品溶液20μL，2.3.2项下对照品溶液5μL、10μL，按2.3.1项下的色谱条件进行测定，计算萜类内酯含量。不同提取溶剂中萜类内酯含量测定结果见表1，液相色谱图见图1。

2.3.4 线性关系考察

精密吸取2.3.2项下混合对照品溶液3，5，10，15，20，25μL，注入液相色谱仪，测定峰面积积分值，以峰面积积分值对数为横坐标(X)，对照品溶液的进样量对数为纵坐标(Y)，进行线性回归。分别得到回归方程: 银杏内酯A：logY =0.8610 log X + 6.282 (r = 0. 999 4)；银杏内酯B：logY =0.9049 log X+5.9501 (r =0. 999 4)；银杏内酯B：logY = 0.8053 logX+6.5398 (r =0. 999 3)；白果内酯：log Y =1.0866 logX +5.8960 (r =0. 999 7)；结果表明银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯分别在 2.442 ～ 20.35μg、2.109 ～17.575μg 、1.803 ～ 15.025μg、1.992 ～ 16.60μg 范围内，进样量的对数与峰面积的对数呈良好线性关系。

2.3.5 精密度试验

精密吸取2.3.2项下对照品溶液5μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，测定峰面积。银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、白果内酯峰面积对数的RSD 分别为 1.08%、 1.97%、 1.46%、1.19%，表明仪器精密度良好。

2.4 总银杏酸含量测定

2.4.1 色谱条件

色谱柱：Shim-pack C18(150mm×4.6mm，5μm；流动相：甲醇 - 1%冰醋酸溶液(90:10)；流速：1mL·min-1；检测波长：310nm。

2.4.2 对照品溶液的制备

精密称取白果新酸对照品、总银杏酸对照品适量，分别加甲醇制成每1m含0. 1004 mg、0. 115mg 的溶液，即得。

2.4.3 供试品溶液的制备与测定

量取2.1项下的5个样品溶液各10mL，浓缩约3mL，加硅胶5g，装柱，以石油醚(60～90℃)40mL洗脱，弃去洗脱液，再以石油醚(60～90℃)-乙醚-甲酸混合液(89：11：1)40mL洗脱，收集洗脱液，低温浓缩至近干，残渣以甲醇溶解并定容至25mL，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液及2.4.2项下对照品溶液各10μL，按2.4.1项下的色谱条件进行测定，以银杏总酸定位，以白果新酸为对照计算总银杏酸含量。不同提取溶剂中总黄酮总银杏酸含量测定结果见表1，液相色谱图见图1。

2.4.4 线性关系考察

精密吸取白果新酸对照品溶液 2，4，8，12，16，20μL，注入液相色谱仪，测定峰面积积分值，以进样量(C)为纵坐标，以峰面积积分值(A)为横坐标，进行线性回归。得回归方程为：Y=188536.164X + 1309.757(r=0.9995)，结果表明白果新酸在0.2008～2.008μg范围内，进样量与峰面积成良好的线性关系。

2.4.5 精密度试验

吸取2.4.2项下对照品溶液10μL，连续进样6次，峰面积RSD=0.96%，表明仪器精密度良好。

3 结论(1)通过对银杏叶五种不同溶剂提取物中总黄酮醇苷、萜类内脂及总银杏酸含量测定可见：总黄酮醇苷含量从高到底的顺序为60%乙醇提取物 > 50%乙醇提取物 > 70%乙醇提取物 > 40%乙醇提取物>水提取物；萜类内脂含量从高到底的顺序为70%乙醇提取物 >60%乙醇提取物 > 50%乙醇提取物 > 40%乙醇提取物，水提取物中未检出萜类内脂成分；总银杏酸含量的顺序与萜类内脂含量顺序一致。为使银杏叶中有效成分黄酮类及萜类内酯成分浸出充分，宜采用60%乙醇提取，但60%乙醇提取液中，毒性成分银杏酚酸含量较高，可高达11.61mg/20mL，远高于百万分之十的限度规定，故提醒百姓为了健康，切不可将银杏叶泡酒饮用。

(2)将水煎煮提取液的取样量增大5倍，亦未检出银杏酸。

(3)在试验中发现采用大孔树脂处理银杏叶提取液，不但可以富集总黄酮醇苷、萜类内脂成分，更可以除去总银杏酸。

[1] 国家药典委员会. 中国药典2010版[M].一部. 北京：中国医药科技出版社，2010：296.

[2] 丁 东，张展鹏，权美平. 银杏叶提取物的化学成分、生物活性及应用研究进展[J].江苏调味副食品，2015(3)：5-8.

[3] 王荞薇，谢媛媛，王义明，等.银杏叶中银杏酚酸类成分含量测定方法研究[J].中国药学杂志，2015，50(3)：167-173.

[4] 国家药典委员会. 中国药典2010版[M].一部. 北京：中国医药科技出版社，2010：392.

(本文文献格式：王兆华，纪义波，张大军.不同提取溶剂对银杏叶药材中多种成分含量的影响[J].山东化工，2016，45(02)：22-24，27.)

Effect of Different Kinds of Solvent in the Contents of Various Components from Ginkgo Leaves

Wang Zhaohua1, Ji Yibo2, Zhang Dajun1

(1. Academy of Chinese Medical Sciences of Jilin Province, Changchun 130012,China;2.Jilin Medical Device Testing Institute, Changchun 130062, China)

Objective To research the effects of water, 40% ethanol, 50% ethanol, 60% ethanol, 70% ethanol on the content of total flavonol glycosides, terpene lactones and total ginkgolic acid in ginkgo leaves，for providing the basis for the reasonable use of the ginkgo leaves. Method Condition of HPLC: the way to test content of total flavonol glycosides was using Shim-pack C18column (150mm×4.6mm，5μm) with methanol -0. 4% phosphoric acid 50∶50, V/V))as mobile phase , the detective wavelength was set at 360 nm. The way to test content of terpene lactones was using Agilent ZORBAX SB-C18 column (250mm×4.6mm,5μm) with methanol-tetrahydrofuran-water (25:10:65, V/V) as the mobile phase, where the drift tube temperature of the evaporative light scattering detector was 105℃ and the flowing rate of carrier gas of it was 2.8L/min. The way to test content of total ginkgolic acid was using Shim-pack C18column (150mm×4.6mm，5μm) with methanol - 1% glacial acetic acid (90:10, V/V)) as the mobile phase, the detective wavelength was set at 310 nm. Result: Quercetin 、kaempferol 、isorhamnetin was linear in the range of 0.0576 ～ 0.576μg、 0.05672 ～ 0.5672μg 、0.04128 ～ 0.4128 g；Ginkgolide A 、ginkgolide B 、ginkgolide C、bilobalide was linear in the range of 2.442～20.35μg、 2.109～17.575μg 、1.803～15.025μg、1.992～16.60μg ；ginkgolic acid was linear in the range of 0.2008 ～2.008μg..The contents of total flavonol glucosides in the extracts prepared from water,40% ethanol, 50% ethanol, 60% ethanol, 70% ethanol refluxing were 2.06, 2.85, 3.20, 3.50, 2.97 mg/20mL. The contents of terpene lactones were 0, 1.04, 1.25, 1.57, 2.08 mg/20mL. The contents of total ginkgolic acid were 0, 7.95, 10.20, 11.61, 12.13 μg/20mL. Conclusion The contents of three components in the solution of different solvents were different. The folk way of taking ginkgo leaves as tea is reasonable, but to take it with wine is prohibited.

ginkgo leaves； total flavonol glycosides； terpene lactones；total ginkgolic acid；HPLC

2015-12-06

吉林省卫生厅项目(20132090)

王兆华(1965—),女，主任药师.研究方向：中药新药与新制剂。

TQ464

A

1008-021X(2016)02-0022-03