APE/Ref-1和Trx1在宫颈癌中的表达及相关性研究

杨明霞， 杨整哉， 曲　群， 段　钊

(西安交通大学第二附属医院妇产科, 西安　710004)



APE/Ref-1和Trx1在宫颈癌中的表达及相关性研究

杨明霞， 杨整哉， 曲群， 段钊

(西安交通大学第二附属医院妇产科, 西安710004)

目的： 探讨宫颈癌中氧化还原因子1(APE/Ref-1)和硫氧还蛋白1(Trx1)的表达及其与宫颈癌相关临床参数的关系。方法采用免疫组化S-P法检测9例正常宫颈组织、20例宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、38例宫颈癌中APE/Ref-1 和Trx1的表达水平，分析各自表达水平与宫颈癌相关临床参数的关系。结果在正常宫颈组织中APE/Ref-1和Trx1均呈低表达，分别为22.2%、12.5%;在宫颈上皮内瘤变(CIN)中均呈中等量表达，分别为65.0%、55.0%;在宫颈癌组织中均呈高表达，分别为84.2%、89.4%；APE/Ref-1的表达与宫颈癌的临床分期、病理分级有关，Trx1的表达与宫颈癌的病理分级、淋巴结转移有关；在宫颈癌组织，APE/Ref-1和Trx1蛋白的表达呈正相关，差异有统计学意义(r=0.557，P=0.000)。结论APE/Ref-1和Trx1可能共同参与了宫颈癌的发生、发展。

宫颈癌； 氧化还原因子1； 硫氧还蛋白1； 免疫组织化学

宫颈癌是目前严重危害妇女健康的第二大恶性肿瘤，在世界范围之内，宫颈癌占女性恶性肿瘤发病的9%，居于第2位[1]。APE/ Ref-1基因定位于人第14号染色体长臂上(14q11. 2～12)，其N端还包括一个核内定位序列或一个核内定位信号(NLS)。APE /Ref- 1 的NH2末端区有Ref-1的氧化还原活性，而COOH2末端区有修复DNA的功能[2]。大量研究表明：APE/Ref-1的亚细胞分布模式和肿瘤细胞的侵袭性及预后密切相关，并发现核内型总是和较好的预后相联系，而APE/Ref-1蛋白的表达水平改变常常与肿瘤放化疗敏感性有关[3]。本研究旨在探讨APE/Ref-1和Trx1在宫颈癌中的表达及其与相关临床参数的关系。

1　材料与方法

1.1研究对象从西安交通大学第二附属医院病理科选取2013年6月-2015年6月经手术切除及病理证实为子宫肌瘤/子宫腺肌症、宫颈上皮内瘤样病变、宫颈癌的宫颈石蜡切块共67例(术前均未行放化疗)。对照组：选取正常宫颈组织9例，均取自于因子宫肌瘤或子宫腺肌症行全子宫切除且术前宫颈刮片未见异常的患者，平均年龄48.4岁；宫颈上皮内瘤样病变(CIN)20例，取自术前因宫颈上皮内瘤样病变行全子宫切除切术且术后病检报告确诊为宫颈上皮内瘤样病变的患者，平均年龄50.2岁。宫颈癌组：选取宫颈癌38例(鳞状细胞癌33例，腺癌5例)，取自术前因宫颈活检证实为宫颈癌且术后确诊为宫颈癌的患者，平均年龄为49.5岁。

1.2免疫组化组织切成4 μm切片，常规脱蜡处理后，水化后梯度酒精脱水，PBS(pH=7.4)冲洗3次，抗原修复后50 μL 过氧化物酶阻断内源性过氧化物酶的活性，抗原封闭50 μL的非免疫性动物血清，将组织周围残存的血清擦干(勿冲洗)，加入适度稀释的(1∶50)APE/Ref-1兔抗人单克隆抗体，然后4℃冰箱过夜；每张切片分别加入50 μL生物素标记的第二抗体山羊抗兔IgG液，室温孵育30 min；DAB显色。参照相关文献[4-5]方法：APE/Ref-1 蛋白和Trx1蛋白均以细胞核或细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性，根据染色强度和阳性细胞百分比两者的乘积，进行半定量分析。

1.3判定标准采用单盲法阅片，每张切片随机选取3～5个高倍视野进行计数(×400)，每个视野中取200个细胞计数。对染色强度打分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。再对阳性细胞数占百分比打分：0分为阴性，1分为阳性细胞数≤10%，2分为11%～50%，3分为51%～75%，4分为>75%。计算染色强度与阳性细胞数百分比乘积，≤3为阴性，>3分为阳性。

1.4统计学分析采用SPSS18.0软件进行统计学分析，根据实验数据和资料特点，本实验资料属于计数资料，服从正态分布，当每一格子期望频数E≥5，且总数≥40例时，采用行*列表资料的χ2检验。但当总数≥40例，而任何一个格子期望值1≤E<5时，采用连续性校正χ2检验。当总数<40例或有期望值<1时，采用Fisher确切概率检验。相关性分析采用Spearman相关系数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1APE/Ref-1在不同宫颈组织中的表达APE/Ref-1蛋白在正常宫颈组织中呈胞核表达，呈淡黄色颗粒(图1a)；而在CIN组织中阳性颗粒呈棕黄色，主要表达于细胞核，偶有细胞质的表达(图1b、c)，阴性表达(图1d)；在宫颈癌组织中阳性颗粒有胞核、胞质、核质共表达3种(见图1e、f、g)。

在67例不同宫颈组织中，APE/Ref-1蛋白的阳性表达率为70.1%，并且随着病变程度的加重，在正常宫颈组织、CIN、宫颈癌中的阳性表达率分别为22.2%、65.0%、84.2%，不同宫颈组织间比较差异有统计学意义(χ2=13.714，P=0.001)；宫颈癌组APE/Ref-1阳性表达率显著高于对照组，两组间比较差异有统计学意义(χ2=11.048，P=0.001)；正常宫颈组织组与CIN组APE/Ref-1阳性率相比差异无统计学意义(P=0.050)，CIN组与宫颈癌组相比差异无统计学意义(χ2=1.786，P=0.181)；CIN组组内比较，APE/Ref-1的阳性表达率逐渐升高，但差异无统计学意义(P=0.160)。

2.2Trx1在不同宫颈组织中的表达Trx1蛋白阳性颗粒主要表达在细胞核或细胞质中，呈棕黄色颗粒，在正常宫颈组织中阳性表达(图2a)；CIN中的阳性表达见(2b、c、d)，弱阳性表达(图2e)，阴性表达(图2f)；在宫颈癌组织中呈胞核或胞质表达(图2f)。

在67例不同宫颈组织中，Trx1蛋白的阳性表达率为68.7%，并且随着病变程度的加重，Trx1蛋白的阳性表达率逐渐升高，在正常宫颈、CIN、宫颈癌中的阳性表达率分别为12.5%、55.0%、89.4%，不同宫颈组织间比较差异有统计学意义(χ2=23.235，P=0.000)；宫颈癌组及CIN组Trx1的阳性表达率显著高于对照组，差异有统计学意义(χ2=19.561，P=0.000；P=0.043)；CIN组与宫颈癌组间Trx1的阳性表达率比较差异有统计学意义(χ2=7.082，P=0.008);CIN组组内比较，Trx1阳性表达率逐渐升高，但差异无统计学意义(P=0.653)。

a: APE/Ref-1在正常宫颈中的表达

b: APE/Ref-1在CINII中的阳性表达

c: APE/Ref-1在CINIII中的阳性表达

d: APE/Ref-1在CINIII中的阴性表达

e: APE/Ref-1在高分化宫颈鳞癌中的阳性表达

f： APE/Ref-1在中分化宫颈鳞癌中的阳性表达

g： APE/Ref-1在低分化宫颈鳞癌中的阳性表达(×400)

图1APE/Ref-1在不同宫颈组织中的表达

a: Trx1在正常宫颈中的阳性表达

b: Trx1在CINII中的阳性表达

c: Trx1在CINII中的阴性表达

d: Trx1在CINIII中的阳性表达)

e: Trx1在CINIII中的弱阳性表达

f: Trx1在宫颈鳞癌中的阳性表达(×400)

图2Trx1在不同宫颈组织中的表达

2.3APE/Ref-1、TrX1蛋白表达与宫颈癌临床病理因素的关系在宫颈癌中APE/Ref-1的阳性表达率与宫颈癌的临床分期、病理分级有关，差异有统计学意义(P=0.030；P=0.042)；APE/Ref-1的阳性表达率与宫颈癌的病理类型、淋巴结是否转移及年龄无关，差异无统计学意义(P=0.169；P=0.094；P=0.234);Trx1的阳性表达率与宫颈癌的病理分级及淋巴结转移有关，差异有统计学意义(P=0.016；P=0.024)，而与宫颈癌的病理类型、病理分级及年龄无关，差异无统计学意义(P=0.446；P=0.124；P=0.513),见表1。

表1　APE/Ref-1、TrX1蛋白表达与宫颈癌临床病理因素的关系

2.4宫颈癌中APE/Ref-1和Trx1表达的相关性在宫颈癌，APE/Ref-1和Trx1蛋白同时有31例呈阳性表达，有3例均呈阴性表达，在APE/Ref-1阴性组Trx1有3例呈阳性表达，在Tx1阴性组APE/Ref-1有1例呈阳性表达，两者的表达呈正相关，差异有统计学意义(r=0.557，P=0.000)，见表2。

表2　宫颈癌中APE/Ref-1和Trx1表达的相关性

3　讨论

缺氧发生在实体肿瘤，这是很多肿瘤包括宫颈癌在内的一个影响肿瘤预后的重要特征。肿瘤组织的缺氧程度主要取决于对肿瘤组织中氧分压的测定，而这个主要是看肿瘤组织的血液供应及其缺氧的程度[7-8]。林爽等[9]通过把宫颈癌Hela细胞暴露在不同氧浓度下测定后发现细胞适度缺氧可促进HIF-1α的表达，降低肿瘤细胞的黏附力，同时使肿瘤细胞侵袭能力增加。细胞暴露在缺氧环境下耐辐射，这是由放射生物学效应(氧效应)来决定的。而目前对于缺氧的癌症患者其预后不良是不能完全用抗辐射效应来解释的，经过手术治疗的患者，其预后不良也与缺氧相关。尹健等[10]通过使用动物模型以及对缺氧的癌症肿瘤患者研究表明：缺氧的肿瘤患者更易发生转移，并且抗凋亡能力比含氧量高的肿瘤患者强。因此研究肿瘤患者缺氧的分子机制受到更多的关注。

APE/Ref-1和Trx1作为体内氧化还原系统中的2个重要的抗氧化蛋白，在机体缺氧过程中发挥了很重要的作用。本研究采用免疫组化(S-P)法联合检测宫颈癌中氧化还原因子(APE/Ref-1)和硫氧还蛋白1(Trx1)的表达情况，分析2个抗氧化蛋白与宫颈癌临床病理特征的关系，并探讨二者之间是否存在相关性。结果发现：与正常宫颈组织相比，宫颈癌中Trx1和APE/ Ref-1的表达均显著升高，Trx1的表达与SugamaK等[11]及脱淑敏等[12]报道的结果是一致的。本研究观察到的Trx1和APE/Ref-1相对于正常的宫颈上皮来说，在宫颈癌癌组织中呈现高表达，并且发现肿瘤细胞分化程度越差，浸润范围越大，Trx1和APE/Ref-1的表达率就越高。并且APE/Ref-1蛋白在随着肿瘤细胞分化程度越差，其表达逐渐由胞核转移至胞质，而Trx1并没有这种移位现象，这可能与宫颈癌细胞在缺氧等环境刺激下，机体对缺氧环境的应答有关。

本实验联合检测Trx1和APE/Ref-1蛋白在宫颈癌中的表达，结果显示两者呈正相关，说明Trx1和APE/Ref-1在宫颈癌组织中表达上调，其表达水平与肿瘤的恶性程度相关，其表达与宫颈癌的病理分级密切相关，而与疾病的病理类型及年龄无关，说明Trx1和APE/Ref-1在宫颈癌组织中的过度表达可能与其发生、发展有关，二者共同作用可能参与了宫颈癌恶化的调控，联合检测Trx1和APE/Ref-1有助于提高宫颈癌预后的评价。

[1]Shepherd JH. Cervical cancer[J]. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 2012, 26(3):293-309.

[2]徐世平, 吴本俨. APE/Ref-1 对细胞因子的调节及与肿瘤的关系[J]. 中华肿瘤防治杂志, 2006, 13(8):630-634.

[3]Biswas A, Khanna S, Roy S ,et al. Endothelial cell tumor growth is Ape/ref-1 dependent[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2015, 309(5):296-307.

[4]闫晶晶, 刘艳霞. Ape/Ref-1 与中枢神经系统疾病的研究进展[J]. 生理科学进展, 2005, 36(4):319-321.

[5]韩建波, 仇毓东, 张炜炜,等. 入肝血流阻断下射频消融后残余肿瘤细胞 HIF-1α及 PCNA 的表达[J].世界华人消化杂志, 2009,17(28) :2887-2891.

[6]Zhou X, Li H, Chai Y, et al. Leptin inhibits the apoptosis of endometrial carcinoma cells through activation of the nuclear factor kappaB-inducing kinase/IkappaB kinase pathway[J]. Int J Gynecol Cancer, 2015, 25(5):770-778.

[7]张曲, 王金凤, 康亚辉, 等. 缺氧诱导因子-1 和肿瘤放射敏感性的研究进展[J]. 中华临床医师杂志:电子版, 2014,8(5):945-949.

[8]赵航, 刘东屏. HIF-1α与实体性肿瘤发生及临床关系的研究进展[J]. 现代肿瘤医学, 2013, 21(9):2134-2137.

[9]林爽, 李力, 王云. 缺氧诱导因子-1α及 E-钙粘蛋白在宫颈癌中的表达及意义[J]. 第三军医大学学报, 2005, 27(10):1026-1029.

[10]尹健, 朱光辉, 单远洲,等. 动物模型在肿瘤微环境研究中的应用[J]. 肿瘤研究与临床, 2015,27(12):854-856.

[11]Sugama K, Suzuki K,Yoshitani K, et al. Changes of thioredoxin, oxidative stress markers, inflammation and muscle/renal damage following intensive endurance exercise[J]. Exerc Immunol Rev, 2015, 21:130-142.

[12]脱淑梅,蔺茹,栾桦. 宫颈癌术后下肢淋巴水肿发生状况及情绪障碍研究[J]. 国外医学:医学地理分册, 2015, 36(3):222-223.

(本文编辑张巧莲)

The expression and correlation research of APE/Ref -1 and Trx1 in cervical carcinoma

YANG Mingxia， YANG Zhengzai， QU Qun， DUAN Zhao

(DepartmentofObstetricsandGynecology,TheSecondAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an710004,China)

ObjectiveTo explore the expression level of oxidation reduction factor-1 (APE/Ref-1) and thioredoxin 1 (Trx1) in cervical cancer, To analysis the relationship between them and clinical pathology. MethodsThis experiment used Immunohistochemistry S-P method to detect the expression of APE/Ref-1 and Trx1 in 9 normal cervical tissue cases, 20 cases of cervical intraepithelial neoplasia and 38 cervical cancer cases. And the results were analysed with relevant statistical methods. ResultsAPE/Ref -1 and Trx1 had weak expression in normal cervical tissue (22.2%， 12.5%), moderate expression in CIN (65.0%， 55.0%) and strong positive expression in cervical cancer ( 84.2%, 89.4%), respectively； The expression of APE/Ref-1 was associated with the clinical stage, pathological classification of cervical cancer， while the expression of Trx1 was associated with the pathological classification and lymph nodes metastasis of cervical cancer. The expression of APE/Ref-1 and Trx1 protein were positively related in cervical cancer, and the difference was statistically significant (γ=0.557, P=0.000). ConclusionThe expression of APE/Ref-1 and Trx1 protein were positively correlated in cervical cancer ,which may suggest that both of proteins may be involved in the occurrence and development of cervical cancer.

cervical cancer; APE/Ref-1； Trx1; Immunohistochemistry

陕西省自然科学基金(2013JM4012)

杨明霞(1988-)，女，在读研究生，研究方向: 妇科肿瘤临床。

段钊，男，博士，副主任医师，硕士生导师，研究方向：妇科肿瘤，E-mail：duanzhao8@163.com。

R34; R737.33

A

1009-5551(2016)06-0731-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.06.016

2016-01-26]