调肝蠲浊颗粒对脂肪肝大鼠模型的调脂保肝功效及机制

刘　晶， 卢　军， 黎耀东

(新疆医科大学附属中医医院药学部， 乌鲁木齐　830000)



调肝蠲浊颗粒对脂肪肝大鼠模型的调脂保肝功效及机制

刘晶， 卢军， 黎耀东

(新疆医科大学附属中医医院药学部， 乌鲁木齐830000)

目的研究调肝蠲浊颗粒对非酒精性脂肪肝大鼠模型的调脂保肝功效及机制。方法Sprague-Dawley(SD)大鼠10只(正常对照组)给予正常饲料喂养，50只大鼠给予高脂饲料喂养6 w，造模成功后，随机分成5组：模型对照组、阳性对照组及调肝蠲浊颗粒低、中、高剂量组。除正常对照组和模型对照组灌胃生理盐水外，阳性对照组灌胃血脂康胶囊(0.12 g·kg-1·d-1)，调肝蠲浊颗粒低、中、高剂量组分别灌胃调肝蠲浊颗粒的水醇提取物，药物干预剂量依次为2.66、5.3、10.6 g·kg-1·d-1。分别检测给药后大鼠血清中胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的水平，通过酶联免疫法(ELISA)检测大鼠血清中过氧化脂质(LPO)、C反应蛋白(CRP)的水平。结果血清血脂指标检测结果显示，与正常对照组比较，模型对照组TC、TG及LDL水平均显著升高，HDL水平有所下降，且差异有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组比较，调肝蠲浊颗粒3个剂量组TG水平无明显变化，TC、HDL以及LDL水平差异有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组比较，调肝蠲浊颗粒高剂量组TC、HDL及LDL水平均降低，差异有统计学意义(P<0.05)，其中调肝蠲浊颗粒高剂量组TC水平降低更明显。血清肝功指标检测结果显示，与正常对照组比较，模型对照组ALT和AST水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组比较，调肝蠲浊颗粒低、中、高3个剂量组ALT和AST水平的影响，依次呈现降低趋势，其中以高剂量组最为明显(P<0.05)；高剂量组与低剂量组、中剂量组ALT和AST水平差异有统计学意义(P<0.05)。血清学指标检测结果显示，与正常对照组比较，模型对照组LPO与CRP水平均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组比较，阳性对照组以及3个剂量调肝蠲浊颗粒药物组LPO与CRP水平均大幅度下降，并以调肝蠲浊颗粒高剂量组最为明显，差异有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组比较，调肝蠲浊颗粒高剂量组的CRP水平差异无统计学意义(P>0.05)，其余剂量组差异均有统计学意义(P<0.05)；高剂量组与低剂量组、中剂量组血清中LPO和CRP水平差异有统计学意义(P<0.05)。结论调肝蠲浊颗粒对高脂血症的治疗及肝脏的保护均具有一定疗效，以降低血清胆固醇水平最为显著，并且能够降低血清中LPO及CRP水平。

调肝蠲浊颗粒； 脂肪肝； 过氧化脂质(LPO)； C反应蛋白(CRP)

脂肪性肝病(fatty liver disease, FLD)作为病理性肝脏损伤的总称，是由于疾病或药物等因素导致肝细胞内脂质积聚超过肝湿重的5%，其通常包括脂肪性肝炎、单纯脂肪性肝病、 肝纤维化以及肝硬化[1]。据最新统计数据显示在我国35～74岁的人群中肥胖者的人数高达1.19亿人，其中有1.26亿人为向心性肥胖者，肥胖人数较1991年增长了1倍[2]，这是一组值得关注的数据。脂肪性肝病不单是对肝脏的损害，其发病过程与“共同土壤——胰岛素抵抗”相联系，使得随之而来的心脑血管疾病的患病风险也逐渐增加[3]。由此可见，脂肪性肝病不可忽视。针对影响FLD发生、发展的主要危险因素，采取与之相对应的有效干预措施，不仅能够减轻终末期肝病的发生、发展和缩短病程，还可以预防心脑血管疾病的发生。

根据脂肪肝的症状、体征，中医学将其归属于“胁痛”、“症瘕”、“湿阻”“痞满”、“肝着”、“肝癖”等范畴。调肝蠲浊颗粒就是在中医理论的指导下，以“虚、痰、瘀、滞”为用药特点，处方中以生黄芪、补骨脂健脾益胃、调补元气，健脾温肾治其虚[4]；生黄芪行气滞，生山楂化食滞，以通其滞；三七粉行血分之瘀，以化其瘀；使邪有出路以祛其痰；全方具有疏肝补肾扶脾、消积活血和消导化痰的作用，临床观察有显著疗效[5]。

本研究基于调肝蠲浊颗粒前期工艺研究基础，考察醇水提工艺制备的调肝蠲浊颗粒对大鼠调脂保肝作用的功效，探讨调肝蠲浊颗粒防治高脂血症的作用靶点和机制。为调肝蠲浊颗粒用于防治脂肪肝和高脂血症提供理论基础及实验依据，也为开发新疆中药资源和促进中药现代化提供理论指导。

1　材料与方法

1.1中药材、试药、试剂和仪器中药材：黄芪、泽泻、大黄等9味药材均采购于安徽省毫州市双华中药饮片厂，经新疆医科大学附属中医医院药学部药检室按照《中国药典》2010年版一部该药材项下的规定进行鉴定和检测，均符合要求。试药：由新疆医科大学附属中医医院药学部药研室提供(批号：20140610)；阳性对照药：血脂康胶囊(北京北大维信生物科技有限公司，批号：20130602)，胆固醇(Cholesterol, 美国Amresco公司，批号：2771C350)，猪胆盐(Bile salt form pig, 上海信誉生物科技有限公司，批号：110318)，丙硫氧嘧啶(德国RIEMSER Aqzneimittel公司，批号：611450)。试剂：水合氯醛(上海万疆生物技术有限公司，批号：20100221)，LPO和CRP试剂盒(上海裕平生物科技有限公司)。仪器：高速低温冷冻离心机(美国Sigma公司)，电子天平(上海精宏实验设备有限公司)，酶标分析仪(ThermoFisher公司)。

1.2实验动物昆明小鼠20只，清洁级，体质量18～20 g，雌性各半；Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，清洁级，体质量160～180 g，雌雄各半[由新疆实验动物研究中心提供，动物合格证号：SCXK(新)2003-0002]。

1.3药物提取制备调肝蠲浊颗粒的水醇提取工艺：第一步将处方的中黄芪、茵陈、苦丁茶以10倍量的水溶液为溶媒进行提取，分别提取2次，提取时间为1 h，合并提取药液，过滤，将滤液以60℃浓缩干燥成相对密度为1.05 g/mL的稠膏；第二步将处方中的泽泻、决明子、山楂、补骨脂、生大黄加10倍量80%乙醇醇提2次，提取时间与过滤浓缩方法同第一步；第三步将水提和醇提的稠膏在60℃以下干燥，粉碎成细分后与三七粉混匀。

1.4急性毒性实验昆明小鼠20只，正常饲养3 d后禁食12 h。采用最大耐受量法[6]，按药物最大允许浓度(1.3 g/mL)和小鼠最大允许容量给小鼠灌胃给药调肝蠲浊颗粒的水醇提取物，当日给药2次，中间间隔2 h，持续观察14 d，分别记录小鼠给药后0、7、14 d体质量改变情况，以及其外观、行为、饮食、分泌物、排泄物等的变化。

1.5高脂饲料制备[7]将2%胆固醇、1%猪胆盐、0.2%丙硫氧嘧啶、10%猪油、5%蛋黄粉、81.8%基础饲料6种成分混合压制后烘干。其中猪油由市售猪油加热，滤过，去渣而成；蛋黄粉是将鸡蛋煮熟后，去除蛋白，将蛋黄粉碎过筛后60℃烘干；基础饲料由新疆实验动物中心提供。

1.6模型的建立及分组正常对照组给予正常饲料喂养，其余均给予高脂饲料喂养6 w。6 w后，大鼠尾静脉采血2 mL，静置20 min后以4 000 r/min离心15 min，取血清。采用酶法检测血清中胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平。根据检测结果将50只大鼠随机分成模型对照组、阳性对照组、调肝蠲浊颗粒低剂量组、调肝蠲浊颗粒中剂量组、调肝蠲浊颗粒高剂量组。

1.7药物干预正常对照组与模型对照组给予生理盐水。阳性对照组给予药物血脂康胶囊，血脂康胶囊人体临床用药量为1.2 g/d，大鼠血脂康胶囊的等效剂量：1.2×6/60 =0.12 g·kg-1·d-1。以调肝蠲浊颗粒临床拟用量计算大鼠等效剂量，人体临床用药量为57 g/d。调肝蠲浊颗粒水醇提组浸膏得率为19%，临床等效剂量：(54×0.19+3)×6/60=1.33 g·kg-1·d-1(3 g为处方中三七粉用量)。确定水醇提取物调肝蠲浊颗粒低、中、高给药剂量分别为2.66、5.3、10.6 g·kg-1·d-1，连续给药8 w，每周根据体质量增长依次调整给药剂量。

1.8血清学检测连续给药8 w后，禁食不禁水12 h，按照体质量0.003 mL/100 g腹腔注射5%水合氯醛进行麻醉后，腹主动脉采血，取血清。分别采用酶法检测血清中TC、TG、HDL和LDL水平以及肝功生化指标ALT 和AST水平。用ELISA方法分别测定血清中过氧化脂质(Lipid Peroxide, LPO)和C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)水平。

2　结果

2.1急性毒性实验结果调肝蠲浊颗粒给药组给药后定时观察，2、4 h时部分小鼠出现倦怠、不适、耸毛等反应，给药后8 h这些症状均明显改善，次日早晨观察恢复正常。14 d后饮食饮水正常，解剖肉眼观察正常，没有死亡小鼠，给药组与正常对照组比较，基线体质量变化差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1　急性毒性实验14 d小鼠体质量的变化(±s， g)

注： F分组=0.010 3，P分组=0.920 3，F时间=394.804 8，P时间<0.000 1，F分组*时间=2.235 7， P分组*时间=0.121 6。

2.2血清血脂生化指标检测结果与正常对照组比较，模型对照组TC、TG及LDL水平均显著升高，HDL水平有所下降，且差异有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组比较，调肝蠲浊颗粒3个剂量组TG水平无明显变化，TC、HDL以及LDL水平差异有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组比较，调肝蠲浊颗粒高剂量组TC、HDL及LDL水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，调肝蠲浊颗粒高中低3个剂量组TC水平差异有统计学意义(P<0.05)，其余指标组间差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.3肝功生化指标及血清学指标检测结果血清肝功指标检测结果显示，与正常对照组比较，模型对照组ALT和AST水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组比较，调肝蠲浊颗粒低、中、高3个剂量组ALT和AST水平依次呈现降低趋势，其中以高剂量组最为明显(P<0.05)；调肝蠲浊颗粒高、中、低3个剂量组比较，高剂量组与低剂量组、中剂量组ALT和AST水平比较差异有统计学意义(P<0.05)，有一定的剂量依赖性；与阳性对照组比较，组间差异均无统计学意义(P>0.05)。

血清学指标检测结果显示，与正常对照组比较，模型对照组LPO与CRP水平均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组比较，阳性对照组以及3个剂量调肝蠲浊颗粒药物组LPO与CRP水平均大幅度下降，并以调肝蠲浊颗粒高剂量组最为明显，差异有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组比较，调肝蠲浊颗粒高剂量组的CRP水平差异无统计学意义(P>0.05)，其余剂量组差异均有统计学意义(P<0.05)；低、中、高3个剂量组比较，高剂量组与低剂量组、中剂量组血清中LPO和CRP水平差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表2　调肝蠲浊颗粒对脂肪肝大鼠模型血清血脂生化指标的影响(±s， n=10)

注：与模型对照组比较，*P<0.05； 与阳性对照组比较，#P<0.05； 与低剂量组比较，△P<0.05。

表3　调肝蠲浊颗粒对脂肪肝大鼠模型血清肝功生化指标的影响及LPO、CRP水平的检测结果(±s， n=10)

注：与模型对照组比较，*P<0.05； 与阳性对照组比较，#P<0.05； 与低剂量组比较，△P<0.05； 与中剂量组比较，▼P<0.05。

3　讨论

脂肪肝是一种较为常见的良性肝脏疾病，现今社会脂肪肝的患病率呈上升趋势，并且患病人群已经越来越趋于年轻化、多样化。有学者认为脂肪肝是代谢综合征的肝脏表现，同时也是代谢综合征的重要组成部分[8]。因此，尽可能早的有效预防和控制糖脂代谢紊乱，对有效预防和治疗高脂血症、心脑血管疾病以及其他代谢性相关性疾病均具有至关重要的科学理论价值和现实指导意义。调肝蠲浊颗粒是我院在临床上使用多年的协定方试剂，并且在长期的临床治疗过程中取得较为良好的治疗效果，在中医理论的指导下，充分体现了“虚湿瘀滞并治、肝脾肾同调、从虚论治”的治疗特点[9]。调肝蠲浊颗粒主要以生黄芪、茵陈为君药，益脾胃、补元气，使邪从中焦而化；以泽泻、决明子、生山楂为臣药，消食化瘀、活血开郁，使邪从小便而泄；以补骨脂、生大黄、三七粉为佐药，补相火、壮元阳，化瘀而不伤正；以苦丁茶作为使药，能够清泄肝热[10]。总体9种中药按照一定比例组方能够调节脂质的代谢，对肝脏具有一定保护作用。

脂肪肝的模型目前较多的采用高血脂动物模型，可以通过高脂饲料的喂养和腹腔注射的方法来进行模型的建立，前者与临床最为接近。本研究综合文献方法，调整一定配比后确定高脂饲料配方，从造模结果来看，与正常对照组比较模型对照组，TC、TG及LDL各指标水平均明显升高，HDL水平降低，ALT和AST的水平明显升高，说明高脂饲料对模型对照组大鼠的肝脏已经造成损伤，达到脂肪肝的病变标准，成功建立了脂肪肝大鼠模型。高、中、低3个剂量组TC和LDL水平降低，但是TG没有明显的改善，提示调肝蠲浊颗粒可能只是对单纯性高胆固醇血症有显著疗效，对于单纯性高甘油三酯血症的疗效有待进一步的确定。与阳性对照组比较，给药组差异无统计学意义，说明该药物对ALT和AST水平的作用与阳性对照药基本一致。除此之外，调肝蠲浊颗粒高、中、低3个剂量组ALT和AST水平的降低，且效果显著，说明该药物对于肝脏有一定的保护作用，临床应用价值较高。本研究后期将着重针对调肝蠲浊颗粒的肝脏保护机制进行进一步的研究。

有研究表明在临床上还没有确诊的冠心病、糖尿病、高血压等慢性代谢性疾病的患者，已经具备了氧化应激增强的条件，氧化应激的改变从肥胖时就已经开始进行，这正是导致慢性代谢性疾病的共同基础所在[11]。国内对肥胖病患者血浆胰岛素水平及其与体质指数和脂肪分布类型的关系已有报道，但尚少见体内氧化应激状态与高血脂、脂肪肝的相关性研究。CRP是一种非特异性的炎症标志物，由内皮细胞、巨噬细胞和脂肪细胞衍生的促炎症细胞因子诱导肝脏产生，非特异性炎症刺激可使其显著升高[12]。CRP具有反应快、敏感、客观的特点，在临床上能够综合评判炎症性疾病的各种炎症反应过程，包括组织坏死的损伤，因此CRP可作为炎症反应恢复期监测、病情评估与疗效判断的重要指标，具有很好的临床价值[13]。脂肪肝形成的机制比较复杂，高脂血症是其发生的重要原因，慢性炎症贯穿其发展的全过程。本实验结果显示，调肝蠲浊颗粒高、中、低3个剂量组脂肪肝大鼠模型血清中LPO和CRP水平均降低，在不同剂量之间存在剂量的差异性，表明该药物对于高脂血症大鼠模型血清中LPO和CRP的干预具有一定的剂量依赖性，剂量越大效果越明显。其中调肝蠲浊颗粒高剂量对于CRP的作用和阳性对照组比较差异无统计学意义，表明两者在降低血清中CRP水平的能力基本一致。与阳性对照组比较，高剂量组LPO水平有所降低，差异有统计学意义，但是调肝蠲浊颗粒高剂量的药效是否优于血脂康胶囊，尚未能定论，需要在后期的研究工作中进一步开展研究才能确定结果。

综上所述，调肝蠲浊颗粒对高脂血症的治疗及肝脏的保护均具有一定疗效，以降低血清胆固醇水平最为显著，并且能够降低血清中LPO及CRP水平，这些均为调肝蠲浊颗粒的新药研发奠定了基础，具有深入研究的现实意义。

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(本文编辑杨晨晨)

Studies on particles of Tiao Gan Juan Zhuo for the model of nonalcoholic fatty liver in rats

LIU Jing, LU Jun, LI Yaodong

(DepartmentofMedicine,AffiliatedTraditionalChineseMedicalHospital，XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830000,China)

ObjectiveTo observe the influences of the regulation for liver on particles of Tiao Gan Juan Zhuo for the model of Hyperlipoidemia in rats. MethodsRats were given high fat diet for 6 weeks to construct model of hyperlipidemia, then the particles of Tiao Gan Juan Zhuo was given. During the drug administration, the level of ALT, AST, TC, TG, HDL, LDL, LPO, CRP were measured. ResultsCompared with normal control group, TC, TG, and LDL levels of model control group increased significantly, HDL levels reduced significantly, the difference was statistically significant (P<0.05); Compared with model control group, the dosage of drug intervention on TG levels had changed, the TC, HDL and LDL levels all had different degrees of improvement, with statistically significant (P<0.05); Compared with positive control group, TC, HDL and LDL levels were statistically significant in high dose group (P<0.05); TC level was only statistically significant compared between dosage group (P<0.05). ALT and AST levels were significantly elevated in model control group compared with normal control group, with statistically significant (P<0.05); Compared with model control group, medicine group was with lower levels of ALT and AST, with statistically significant (P<0.05). Comparison between dosage group, give the dose and liver meritorious service is negatively related to the level of biochemical indicators of ALT and AST level, with statistically significant (P<0.05); Compared with positive control group, the differences between groups were no statistical significance (P<0.05). Compared with the positive control group, CRP level between cloud particles Tiaogan Juan high-dose group was not statistically significant (P>0.05), the remaining dose group differences were statistically significant (P<0.05); LPO and CRP serum levels in high dose group and low dose group was statistically significant (P<0.05). ConclusionTheparticles of Tiao Gan Juan Zhuo shows clear improvement for hyperlipidemia and the protection of liver. Reducing the serum is the most significant effect. The levels of serum LPO and CRP can reduced by Particles of Tiao Gan Juan Zhuo.

Particles of Tiao Gan Juan Zhuo; fatty liver; LPO; CRP

新疆医科大学科研创新基金(ZYY201433)

刘晶(1985-)，女，硕士，主管药师，研究方向：中药药理研究。

黎耀东，男，硕士，主任药师，研究方向：中药复方制剂的新药研发，E-mail：liyaodongno1@163.com。

R961.1

A

1009-5551(2016)06-0712-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.06.011

2015-03-29]