低剂量iAs5+染毒对兔血清ET-1、sP-选择素及vWF的影响

胡蓓蓓， 马　艳， 张　杰， 吴　军， 郑玉建

(新疆医科大学公共卫生学院， 乌鲁木齐　830011)



低剂量iAs5+染毒对兔血清ET-1、sP-选择素及vWF的影响

胡蓓蓓， 马艳， 张杰， 吴军， 郑玉建

(新疆医科大学公共卫生学院， 乌鲁木齐830011)

目的探讨低剂量五价无机砷(iAs5+)染毒对新西兰大耳兔血清中ET-1、sP-选择素及vWF含量的影响。方法健康雄性新西兰大耳兔42只，随机分为对照组和6个iAs5+染毒剂量组，染毒组饮水中给予砷酸钠溶液染毒，所有动物自由饮水，进食。染毒3个月，麻醉后处死动物，采集动物血液、尿液以及各脏器样本，利用石墨炉原子吸收光谱法测定血、尿、心脏和肝脏总砷含量，采用酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)测定血清中ET-1、sP-选择素及vWF的含量。结果染毒组的血砷、尿砷和肝脏砷含量均值均高于对照组，各染毒剂量组血砷和尿砷含量的差异有统计学意义(F=8.402，F=9.313，P均<0.05)，肝脏砷和心脏砷含量的差异无统计学意义(F=1.763，H=4.284，P均>0.05)；各染毒剂量组ET-1、sP-选择素含量均高于对照组，且组间差异有统计学意义(H=31.015，F=70.225，P均<0.05)，ET-1含量与血砷、尿砷含量呈正相关(r=0.592，r=0.467，P均<0.05)，sP-选择素含量与血砷、尿砷、肝脏砷含量呈正相关(r=0.768，r=0.717，r=0.435，P均<0.05)。结论低剂量亚慢性iAs5+染毒可对血清中ET-1和sP-选择素的含量造成一定影响。

砷； 内皮素1； 血管性假血友病因子； 可溶性P-选择素

砷是自然界中存在的一种常见的元素，通过自然沉降或者人为活动，砷及其化合物可出现在空气、土壤和水等环境介质中。环境中的砷主要以亚砷酸盐的形式经饮用水途径进入机体，饮用水砷暴露和砷的不完全甲基化能力会增加患致命性和非致命性心血管疾病，尤其是心脏疾病的风险[1]。血管内皮细胞在机体中有很重要的作用，其能介导组织器官中氧和营养物质的传送，血液中有毒金属含量过高或长期暴露于含有有毒金属的血液中，造成内皮受损，可能导致心血管疾病的发生。内皮素1(Endothelin-1, ET-1)、血管性假血友病因子(vonWillebrand factor, vWF)以及可溶性P-选择素(sP-selectin)是比较敏感的内皮损伤标志物，外周血中ET-1、vWF以及sP-选择素的含量的变化即可反映血管内皮细胞的功能状态。本研究利用低剂量iAs5+砷染毒兔模型，观察不同染毒剂量下动物脏器系数、血清ET-1、vWF以及sP-选择素等指标的变化情况，为进一步了解低剂量亚慢性砷染毒对血管内皮的损伤作用提供一定的理论依据。

1　材料与方法

1.1仪器和试剂AA240FS原子吸收分光光度仪(美国VARIAN公司)，AS-1空心阴极灯(北京有色金属研究总院)，680型全自动酶标仪(美国BIO-RAD公司)，MP5002电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；砷酸钠(分析纯，湖南凤凰化工试剂厂)，硝酸(北京化工厂)，高氯酸(天津市东方化工厂)，砷标准品(国家标准物质研究中心)，硝酸镍(北京双环化学试剂厂)。

1.2染毒方法选用新疆医科大学实验动物中心提供的普通级新西兰大耳兔42只，雄性，体质量为(2.0±0.2)kg。动物饲料由新疆医科大学实验动物中心提供。正式实验前试饲养观察1 w，按体质量随机分为对照组和6个iAs5+染毒组，每组6只，根据预实验得到兔iAs5+的LD50为20.21 mg/kg，染毒组的iAs5+剂量分别为LD50的1/960、1/480、1/240、1/120、1/60、1/30，即从染毒剂量组1到剂量组5 iAs5+的染毒剂量分别为0.021、0.042、0.084、0.168、0.337、 0.674 mg/kg。对照组：自由进食，自由饮水。染毒组：自由进食，自由饮水染毒，连续染毒3个月。

1.3染毒动物血砷、尿砷、心脏砷含量的测定

1.3.1样品的预处理取抗凝全血、尿液0.5 mL加入50 mL三角烧瓶中消化。步骤：每个烧瓶中分别加入混合酸(硝酸∶高氯酸=4∶1)5 mL，置于电热板上75℃消化1 h，120℃消化1 h，150℃消化至溶液透明，取下待冷却后加入高纯水5 mL定容，待测。心脏、肝脏组织匀浆后，分别取0.5 mL匀浆液，进行消化，定容后待测。

1.3.2石墨炉原子吸收光谱法测定砷含量利用原子吸收分光光度仪测定样本砷含量：配制砷标准溶液100 μg/L，按照预先设定好的程序，上机测定，绘制出标准曲线；配制100 μg/mL的硝酸镍作为基体改进剂，各样本管中加入1 000 μL待测样品和50 μL硝酸镍混匀，上机测试，根据绘制的标准曲线和吸光度值，得到各样本的砷含量。

1.4血清ET-1、vWF和sP-选择素含量的测定染毒3个月后，麻醉处死动物，在腹主动脉取2 mL非抗凝血，静置，2 h内离心10 min(3 000 r/min)，分离血清，置于2 mL EP管中，然后严格按照ELISA试剂盒(上海GOYBIO生物公司)操作说明书测定血清中ET-1、vWF和sP-选择素含量。

2　结果

2.1iAs5+染毒兔血砷、尿砷、心脏砷、肝脏砷的变化情况经方差分析得出，染毒组和对照组的血砷、尿砷含量的总体均数不全相等，差异有统计学意义(F=8.402，F=9.313，P均<0.05)，各染毒剂量组的血砷、尿砷含量均值均高于对照组。两两比较结果显示，染毒剂量组1的血砷含量与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，染毒剂量组3、剂量组5和剂量组6的尿砷含量与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；各染毒剂量组肝脏砷含量均高于对照组，但差异无统计学意义(F=1.763，P>0.05)；由于方差不齐，采用秩和检验，各组间心脏砷含量的差异也无统计学意义(H=4.284，P>0.05)，见表1。

表1　iAs5+染毒兔血、尿、心脏和肝脏总砷含量(±s， μg/L)

注：与对照组比较,*P<0.05。

2.2iAs5+染毒对兔血清ET-1、vWF及sP-选择素含量的影响经检验ET-1和vWF不满足方差齐，所以采用秩和检验比较，各染毒剂量组ET-1含量的差异有统计学意义(H=31.015，P<0.05)，各染毒剂量组ET-1含量均高于对照组，染毒剂量组4、剂量组5和剂量组6与对照组ET-1含量相比差异有统计学意义(P<0.05)，染毒组与对照组vWF总体均数的差异无统计学意义(H=4.185，P>0.05)；经方差分析得到，染毒组与对照组sP-选择素总体均数的差异有统计学意义(F=70.225，P<0.05)，各染毒剂量组sP-选择素含量均高于对照组，且随染毒剂量的增加而升高，除剂量组1外，其余各染毒剂量组与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05) ，见表2。

经Pearson相关分析得到，ET-1含量与血砷、尿砷含量呈正相关(r=0.592，r=0.467，P均<0.05)，sP-选择素含量与血砷、尿砷、肝脏砷含量呈正相关(r=0.768，r=0.717，r=0.435，P均<0.05)，见表3。

分组ET-1/(pg/mL)vWF/%sP-选择素/(ng/mL)对照组105.023±10.739125.448±12.39420.124±3.216染毒剂量组1109.842±23.136125.806±10.73725.709±7.801染毒剂量组2113.973±20.890125.806±11.25329.894±2.749*染毒剂量组3118.964±13.517134.274±10.49840.603±4.940*染毒剂量组4153.806±6.251*133.871±19.72258.865±7.520*染毒剂量组5148.941±4.091*138.038±21.37969.060±7.878*染毒剂量组6155.180±7.051*147.312±28.81474.734±7.460*

注：与对照组比较 ,*P<0.05。

3　讨论

慢性砷中毒是一个全球化的卫生问题，长期饮水砷暴露可引起慢性砷中毒，导致多器官、系统如肝脏、心脏、血液系统等受损[2]。慢性暴露在饮水砷含量 5～10 μL/L的环境中都会造成砷引起的皮肤损伤的发病率增加[3]。研究发现，低水平砷暴露与心血管疾病尤其是心脏疾病死亡率之间也存在剂量-反应关系[4]。

表3不同暴露标志与血砷、尿砷、心脏砷和肝脏砷的相关性分析(n=42)

分组ET-1/(pg/mL)vWF/%sP-选择素/(ng/mL)血砷 0.592* 0.170 0.768*尿砷 0.467* 0.356 0.717*心脏砷-0.214-0.357-0.199肝脏砷 0.186-0.157 0.435*

注：*P<0.05。

砷经消化系统部分进入血液，分布到全身各组织器官中，然后经尿液排出体外。本实验中，染毒组血砷及尿砷浓度均高于对照组且差异有统计学意义，砷暴露会导致各脏器组织中均有砷蓄积，但分布并不均匀，血砷和尿砷含量可在一定程度上反映砷在体内的负荷情况[5-6]。肝脏是砷的代谢场所，本实验中染毒组肝脏中砷含量均高于对照组，但染毒组和对照组肝脏砷含量和心脏砷含量的差异均无统计学意义，说明低剂量砷在脏器中的蓄积不明显。

慢性砷中毒可以导致心血管疾病的发生，而ET-1具有收血管作用，多种心血管疾病的病理生理过程中均有ET-1的参与[7]。本实验中染毒组与对照组ET-1含量的差异有统计学意义，且高剂量染毒组ET-1含量高于对照组。心肌缺血可以导致内皮素大量释放，通过降低血中ET-1浓度，才能有效地阻止内皮细胞损伤的加重[8]。本实验中染毒组ET-1浓度升高，说明染毒动物可能出现了心肌缺血的症状。ET-1含量与血砷、尿砷含量呈正相关关系，当血砷、尿砷含量升高时提示血清中ET-1的释放也会增加。

sP-选择素是内皮细胞活化的标志物，参与了多种炎症介质的释放，在炎症早期发展过程中起着重要作用[9-10]。本实验中，sP-选择素含量会随血砷、尿砷、肝脏砷含量的增加而增加，染毒组sP-选择素含量均高于对照组，且随染毒剂量的升高而增加，除最低的染毒剂量组外，其余各染毒组与对照组的差异均有统计学意义，说明染毒组动物血管内皮细胞可能出现炎症损伤，从而导致血清中sP-选择素升高。

vWF是一种多聚糖蛋白，可由内皮细胞合成，参与血小板的黏附和聚集[11]。由于循环血浆内的vWF大部分来源于血管内皮细胞，血浆vWF含量的变化通常能反映出内皮细胞功能的状态，当内皮功能损伤时vWF水平会有一定升高[12]，通过血浆中vWF含量来预测未来发生缺血性心肌病的风险。本实验中染毒组与对照组vWF含量差异无统计学意义，可能是由于低剂量砷暴露对血清中vWF影响不明显。

综上所述，低剂量的iAs5+染毒也能导致血清中ET-1和sP-选择素的含量升高，并且ET-1和sP-选择素的含量与血砷、尿砷浓度呈正相关，ET-1和sP-选择素可能也可以作为低剂量砷中毒内皮损伤的标志物。

[1]Chen Y, Wu F, Liu ML, et al. A Prospective study of arsenic exposure, arsenic methylation capacity, and risk of cardiovascular disease in bangladesh[J].Environ Health Perspect,2013,121(7):832-838.

[2]于云江,王菲菲,房吉敦,等.环境砷污染对人体健康影响的研究进展[J].环境与健康杂志,2007,24(3):181-183.

[3]Xia YJ, Timothy J, Wade, et al.Well water arsenic exposure, arsenic induced skin-lesions and self-reported morbidity in inner mongolia[J] .Int J Environ Res Public Health,2009,6:1010-1025.

[4]Medrano MA, Boix R, Pastor-Barriuso R, et al. Arsenic in public water supplies and cardiovascular mortality in Spain[J]. Environ Res, 2010,110(5):448-454.

[5]高怡,仇玉兰,田凤洁,等.饮水砷暴露大鼠血砷、尿砷和组织砷含量测定分析[J].山西医科大学学报,2011,4(1):33-36.

[6]马栓柱,许秀举,罗绥兰,等.饮水型砷中毒大鼠尿砷、血砷和毛发砷含量变化及其相关性研究[J].现代预防医学，2007,34(1):40-41.

[7]Glowinska B, Urban M, Hryniewicz A, et al. Endotheli-1 plasma concertration in children and adolescents with atherogenic risk factors[J].Kardiol Pol, 2004,61(10):329-338.

[8]陈雪君,雷凡,段薇娜.羟乙基淀粉对兔缺血-再灌注心肌MPO和ET-1的影响[J].广西医学,2014,36(2):158-161.

[9]刘艳秋,高美华,李红林,等.糖尿病及糖尿病病发冠心病患者血清sP-selectin、sE-selectin水平变化及意义[J].中国免疫学杂志,2015,31(9):1245-1249.

[10]何剑戈,任爱红,施懿诚,等.肝缺血再灌注损伤的机制及其预防[J].河南科技大学学报:医学版,2012,30(3):235-237.

[11]Federici AB. The factor VIII/yon Willebrand factor complex：basic and clinical issues[J].Haematologica,2003,88(6):34-38.

[12]Constans J, Conri C. Circulating markers of endothelial function in cardiovascular diseasc[J].Clin Chem Acta,2006,368(1-2):33-47.

(本文编辑张巧莲)

Effect on ET-1, sP-selectin and vWF with low-dose pentavalent inorganic arsenic exposure in rabbits

HU Beibei， MA Yan， ZHANG Jie， WU Jun， ZHENG Yujian

(CollegeofPublicHealth,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

ObjectiveTo explore the effects on ET-1, vWF and sP-electin in rabbits′ serum with low-dose pentavalent inorganic arsenic (iAs5+) exposure. Methods42 healthy male New Zealand rabbits were randomly divided into the control group and the exposure group, which were divided into 6 groups from low to high dose, and exposure groups were given sodium arsenate solution in drinking water. All the rabbits ate and drank water freely. After three months, the animals were killed after anesthesia, collected blood, urine and viscera samples. To detect the concentration of arsenic in blood, urine, liver and heart by graphite furnace atomic absorption spectrometry. ET-1, vWF and sP-selectin were determined by ELISA kit. ResultsThe arsenic in blood , urine and liver of exposure groups were higher than those in control group, and the differences of arsenic in blood and urine between each group were statistical significance (F=8.402，F=9.313，P<0.05). There was no significant difference in liver arsenic and heart arsenic (F=1.763，H=4.284，P>0.05). ET-1 and sP-selectin in exposure group were higher than that in control group, and the differences of ET-1 and sP-selectin in each group were statistical significance (H=31.015，F=70.225，P>0.05). There is a positive correlation between the content of ET-1 and the arsenic in blood or urine (r=0.592，r=0.467，P<0.05), and there is also have a positive correlation between the content of sP-selectin and the arsenic in blood, urine or liver (r=0.768，r=0.717，r=0.435，P<0.05). ConclusionLow dose iAs5+exposure have some certain effects on ET-1, sP-selectin in serum.

arsenic； endothelin1； von willebrand factor； sP-Selectin

国家自然科学基金(81260410); 国家自然科学基金(81560513)； 教育部博士点基金(20126517110002)

胡蓓蓓(1991-)，女，在读硕士，研究方向：环境与健康。

郑玉建，男，博士，教授，博士生导师,研究方向：环境与健康，E-mail：zhyujian6@hotmail.com。

R-33; R34

A

1009-5551(2016)06-0668-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.06.002

2016-03-12]