多壁碳纳米管-Nafion/纳米金构建阻抗传感器研究*

胡晓琴，李晓霞，高楼军（延安大学化学与化工学院，陕西延安716000）

多壁碳纳米管-Nafion/纳米金构建阻抗传感器研究*

胡晓琴，李晓霞，高楼军
（延安大学化学与化工学院，陕西延安716000）

利用多壁碳纳米管（MWNT）—Nafion和纳米金（GNPs）修饰金电极构建了一种简单、灵敏检测人端粒DNA的电化学阻抗传感器。首先将Nafion分散的MWNT滴涂于Au电极表面，再利用电化学沉积法将GNPs沉积到MWNT—Nafion修饰Au电极表面，以GNPs为载体固定人端粒探针DNA制备DNA传感器。在最优实验条件下，将传感器用于人端粒DNA的检测中，结果表明：目标人端粒DNA的线性范围为1.0× 10-13～5.0×10-11mol/L，检出限（S/N=3）为2.5×10-14mol/L。采用MWNT为基底沉积GNPs修饰电极检测的灵敏度显著提高。

电化学阻抗传感器；多壁碳纳米管；纳米金；人端粒DNA

0　引言

端粒DNA是真核生物线状染色体末端的DNA重复序列，在保持染色体的完整性和维持细胞的复制能力方面起着重要作用。端粒酶则是由RNA和蛋白质亚基组成的，能够延长端粒的一种特殊的反转录酶。端粒结合蛋白可以通过调节端粒酶的活性来调节端粒长度，进而控制细胞的衰老、永生化和癌变［1，2］。研究表明：正常细胞中，细胞的每一次复制会导致端粒DNA的50～200个碱基的缺失，端粒DNA的不断丢失将会导致染色体不稳定，当缩短到一临界值时，就丧失了对端粒DNA的保护能力，从而触发了细胞走向衰老［3，4］。因此，建立简单、灵敏检测端粒DNA的方法具有十分重要的意义。

电化学阻抗传感器因其操作简便、灵敏度高、无需标记、不破坏测试体系、可直接检测等优点，被用于DNA序列、细胞和蛋白质等生物样品的检测［5，6］。目前报道了利用纳米材料作为电极修饰材料来提高电化学传感器的分析性能。金纳米（GNPs）粒子和碳纳米管（carbon nanotube，CNTs）因其良好的电学特性和生物相容性成为电极修饰材料的首选，而被广泛应用于电化学生物传感器的研究［7，8］。而基于多壁碳纳米管（multi-walled nanotube，MWNT）-Nafion/（GNPs）修饰金电极构建电化学阻抗DNA传感器的研究未见报道。本文以人端粒DNA为分析对象，首次构建了基于MWNT-Nafion/GNPs修饰金电极高灵敏检测DNA的阻抗传感器。该DNA传感器制作简单，操作方便，且无需标记，将阻抗技术的高灵敏与DNA杂交的高选择性结合，可有望用于肿瘤疾病的早期诊断、基因序列分析和环境监测等。

1　实验

1.1仪器与试剂

CHI660E电化学分析仪（上海辰华公司）。三电极系统：Au电极（φ=2 mm）及其修饰电极为工作电极，参比电极为饱和甘汞电极，铂丝为对电极。

MWNT（深圳纳米港）；四氯金酸（HAuCl4·H2O，国药集团）。6—巯基己醇（MCH）和0.1%Nafion（Sigma—Aldrich公司）。探针人端粒DNA序列为：5'—TTA GGG TTA GGG—C6—3'，目标人端粒 DNA序列：5'—CCC TAA CCC TAA—C6—3'（生工生物工程有限公司）。DNA序列储备液为10 mmol/LPBS（pH=7.0）；杂交液为10 mmol/LPBS（pH= 7.0）—0.1 mol/L KCl；5.0 mmol/L Fe4［K（CN）6］—5.0 mol/L Fe3［K（CN）6］以0.1 mol/L PBS—0.1 mol/L KCl（pH=7.4）配制。

1.2传感器的制备

MWNT和Au的预处理参见文献［9，10］。

将预处理好的Au电极在0.1 mol/L H2SO4溶液中，电位范围-200～1600 mV循环伏安扫描至稳定。2 μL 1 mg/ mL的MWNT和0.1%的Nafion—乙醇溶液混合，超声分散均匀后滴涂到预处理好的Au电极表面，放至室温自然晾干备用。然后将修饰电极（MWNT—Nafion/Au）置于6 mmol/L HAuCl4溶液中，-200 mV恒电位沉积80 s［11］，所得电极记为GNPs/MWNT—Nafion/Au。将5 μL 1.0 μmol/L探针人端粒ssDNA溶液滴在GNPs/MWNT—Nafion/Au表面，4℃下放置10 h，得到修饰电极标记为ssDNA/GNPs/MWNT—Nafion/ Au。滴涂5.0L 1.0mmol/L MCH，室温暗处孵育2h，分别用PBS（pH 7.0）和二次蒸馏水清洗，制备得传感器记为ssDNA/MCH/GNPs/MWNT—Nafion/Au。

1.3电化学检测

将5.0 L不同浓度目标DNA滴在传感器表面，37℃杂交反应100 min。然后分别用10 mmol/L pH=7.0 PBS和二次蒸馏水冲洗。将杂交后的电极在 5.0 mmol/L ［Fe（CN）6］3-/4-溶液中进行循环伏安扫描和电化学阻抗测定。扫描范围-200～600 mV，扫速为50 mV/s。电化学交流阻抗外加电压为0.22 V，频率变化范围为100 kHz～1.0 Hz。

2　结果与讨论

2.1传感器的循环伏安和阻抗法表征

修饰电极和杂交反应后电极的循环伏安行为如图1所示。曲线a为裸Au电极在［Fe（CN）6］3-/4-中的氧化还原峰电位差ΔE=80 mV，具有良好的可逆性。MWNT—Nafion修饰Au电极（曲线b）的ΔE降低为72 mV，归因于Nafion 是MWNT的良好分散剂，MWNT良好的导电性加速了电子在溶液和电极之间的传递。GNPs沉积后所得的修饰电极使得平衡电对的电位差继续减小ΔE=68 mV（曲线c），可能是沉积的GNPs进一步促进了电子的传递速率。当探针DNA固定到修饰电极时（曲线d），由于DNA磷酸骨架上的负电荷使得［Fe（CN）6］3-/4在电极上的传质过程受到抑制，ΔE=119 mV且峰电流减小。MCH封闭修饰电极空余的未结合位点（曲线e），ΔE继续增大且峰电流继续降低。杂交后由于形成双链DNA结构，进一步阻碍了平衡电对的传递，ΔE=224 mV且峰电流降到最低（曲线f）。

图1　电极修饰和杂交过程的循环伏安图Fig 1　Cyclic voltammograms of modification of electrode and hybridization

实验采用电化学阻抗法对传感器的组装过程进行了表征。结果发现，裸Au电极的阻抗谱图在高频区部分出现一个很小的半圆，电子传递电阻 Ret=162.6 Ω。当修饰MWCT—Nafion后，半圆直径变小（Ret=114.6 Ω），这说明MWCT—Nafion提高了平衡电对的电极传递。GNPs沉积后，阻抗谱图在高频区部分接近一条直线，说明GNPs加快了［Fe（CN）6］3-/4-的电子传质。将探针DNA固定到修饰电极表面，半圆直径明显变大（Ret=803.9 Ω），表明固定探针DNA后阻碍了［Fe（CN）6］3-/4电子传递。MCH封闭后，Ret增大到1 646 Ω。最后杂交反应后其电子传递阻抗值Ret达到2089 Ω，说明双链阻碍了电化学探针在电极表面的反应。

2.2实验条件优化

分别对GNPs电化学沉积时间、DNA的固定时间、杂交时间和杂交温度进行了优化。结果如图2所示，最佳实验条件选择沉积时间80s，固定时间为10h，杂交温度为37℃，杂交时间为90 min。

2.3传感器的分析性特能

在上述最佳优化实验条件下，以MWNT—Nafion/GNPs为修饰剂制备了DNA传感器，对目标人端粒DNA进行定量测定，结果如图3所示。发现目标人端粒DNA浓度的对数在1.0×10-13～5.0×10-11mol/L范围内，与传感器杂交前后阻抗变化值 ΔRet呈良好的线性关系，线性方程为ΔRet（kΩ）=14.38+0.988 7 lgC（C/（mol/L）），相关系数R=0.9976，检出限（S/N=3）为2.5×10-14mol/L。与文献报道的，如茜素/石墨烯—壳聚糖修饰玻碳电极［12］，GNPs修饰 Au电极［13］，裸 Au电极［14］，GNPs为标记物［15］测定DNA的方法相比，MWNT—Nafion/GNPs修饰Au电极电化学阻抗法具有灵敏度高、线性范围宽、检出限低、操作简便等优点。

图2　实验条件对杂交效率的影响Fig 2　Effect of experimental condition on hybridization efficiency

在最优化实验条件下，用修饰电极制备的传感器对5.0×10-12mol/L的目标人端粒DNA11次平行测定，相对标准偏差为4.6%。用相同方法制备11只相同的传感器，用于测定浓度为5.0×10-12mol/L的目标人端粒DNA，相对标准偏差（RSD）为5.0%，表明该传感器有较好的重现性。将制备好的传感器储存7，15天后，分别用于同浓度目标DNA的测定，阻抗降低值分别小于3.6%和8.9%，说明该传感器在短时间内具有良好的稳定性。

图3　不同浓度的目标DNA杂交的阻抗图和工作曲线图Fig 3　Impedance and working curve diagrams of target DNA hybridization with different concentrations

3　结论

本文基于 MWNT—Nafion/GNPs修饰，以人端粒探针DNA为分子识别物质，构建了一种非标记型电化学阻抗测定人端粒DNA的电化学传感器。该传感器线性范围宽，灵敏度高，且无需标记、操作简单，稳定性好，可望用于肿瘤疾病的早期诊断、基因序列分析和环境监测等。

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李晓霞，通讯作者，E—mail：ydlxx@yau.edu.cn。

Research on MWNT-Nafion/GNPs modified impedance sensor*

HU Xiao-qin，LI Xiao-xia，GAO Lou-jun
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Yan'an University，Yan'an 716000，China）

A novel electrochemical impedance sensor for determination of human telomere DNA is developed on basis of MWNT-Nafion/gold nanoparticles（GNPs）modified electrode.The bare Au electrode is first coated with MWNT Nafion films by dropping，and then GNPs are electro chemical deposited onto surface of MWNT-Nafion modified Au（MWNTs-Nafion/GNPs/Au）electrode.Then DNA is fabricated by using GNPs as carrier to immobilize human telomere DNA.Under the optimized experimental conditions，the sensor is used in detection of human telomere DNA，the result shows that the target human telomere DNA concentration is in the range of 1.0× 10-13～5.0×10-11mol/L which has good linear relationship with a detection limit of 2.5×10-14mol/L（S/N= 3）.Selectivity of detection is obviously improved using MWNT as substrate deposited GNPs modified electrode. Key words：electrochemical impedance sensor；multi-walled carbon nanotubes（MWNT）；gold nanoparticles （GNPs）；human telomere DNA

O657.1

A

1000—9787（2016）06—0021—03

10.13873/J.1000—9787（2016）06—0021—03

2015—09—30

陕西自然科学基础研究计划资助项目（2010JM2020）；延安大学科研计划资助项目（YD2014—04）

胡晓琴（1991-），女，陕西榆林人，硕士研究生，主要研究方向为电分析化学。