沙枣中总黄酮的提取工艺优选

王红玉，本莲芳，王安琪，张海亮

(兰州石化职业技术学院，甘肃　兰州　730060)



沙枣中总黄酮的提取工艺优选

王红玉，本莲芳，王安琪，张海亮

(兰州石化职业技术学院，甘肃兰州730060)

优选沙枣中总黄酮的提取工艺条件，并通过还原力的测定初步研究黄酮的抗氧化活性。以总黄酮提取率为指标，采用单因素考察乙醇浓度、超声时间、料液比、超声功率对沙枣黄酮提取率的影响；在单因素试验的基础上，采用正交设计法优化沙枣中总黄酮的提取工艺条件。沙枣黄酮提取的最佳工艺条件：乙醇浓度 60%、超声时间15 min、料液比1:22 (g/mL)、超声功率320 W，在此条件下，沙枣黄酮的提取率8.64%，影响沙枣黄酮提取率的因素从大到小依次为：料液比>超声时间>乙醇浓度>超声功率；通过还原力的测定,表明沙枣总黄酮有较好的抗氧化活性。

沙枣；总黄酮；提取工艺；抗氧化活性

沙枣(Elaeagnus angustifolia L.)属于胡颓子科，胡颓子属。沙枣是药用价值非常高的一种荒漠盐生植物资源，其营养价值很高，果实富含维生素、糖、蛋白质、矿物质、淀粉及果胶等[1]。研究发现，沙枣中含有一定量的黄酮类化合物，黄酮类化合物的生理作用具有多样性，具有降低血清胆固醇、抑制血小板集聚、抗溃疡、抗肿瘤、抗炎、抗过敏、增强免疫力治疗和慢性气管炎等功效[2-4]。因此，沙枣是一种具有开发利用前景的重要资源。但目前沙枣仅有少部分在民间药用、食用或初步加工，大部分果和叶成熟后自然落地腐烂废弃，利用率极低，造成这一宝贵资源的极大浪费。为了提高沙枣中黄酮类化合物的提取率，进而提高这一宝贵资源的应用价值，对沙枣中黄酮类化合物的提取工艺进行了研究。采用超声辅助-溶剂法提取沙枣中总黄酮[5-6]，提取率较单纯溶剂法提取黄酮的提取率高。提取出总黄酮后，通过还原力的测定初步研究沙枣总黄酮的抗氧化活性[7]。

1　试剂与仪器

1.1试剂

沙枣(甘肃古浪)，经兰州理工大学史高峰教授鉴定为胡颓子科植物。

芦丁对照品(纯度92.5%，批号100080-200707)，中国药品生物制品检定所；CH3CH2OH,天津市百世化工有限公司；NaH2PO4、Na2HPO4,天津市天新精细化工开发中心；蒸馏水；NaNO2,西安化学试剂厂；Al(NO3)3,上海试剂四厂；NaOH,天津市化学试剂厂；K3Fe(CN)6、FeCl3,天津市双船化学试剂厂，试剂均为分析纯。

1.2仪器

U-2001型紫外可见分光光度计,日本Hitachi；AL204型电子分析天平,梅特勒·托利多仪器(上海)有限公司；高速台式离心机(TC16-WS),长沙湘仪离心机有限公司。

2　方法与结果

2.1标准曲线绘制

精密称取20 mg芦丁[8]，加无水乙醇溶解，定容至100mL容量瓶中，配制浓度为0.2 mg/mL备用。准确吸取芦丁对照品溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分别置于25mL的比色管中,依次加入5%的NaNO2溶液0.3mL，摇匀，放置6 min，再加入10%的Al(NO3)3溶液0.3mL，摇匀，放置6 min，最后加入4%的NaOH溶液4.0mL，用60%的乙醇定容，摇匀，放置15 min，在498 nm波长处测定吸光度(A)，以A为纵坐标，质量浓度为横坐标，得线性回归方程Y=10.59x-0.0012(R2=0.9999)。

2.2沙枣中总黄酮的提取率测定

称取2.00 g沙枣粉，按一定的料液比、乙醇浓度，超声功率和超声时间提取后，4000 r/min离心10 min，取上清液移至50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。分别取100 μL样液移至10mL的容量瓶中，平行3次，按照标准曲线的制作方法在最大吸收波长处测定吸光度，计算黄酮提取率。

式中：Y——总黄酮提取率，%

m——黄酮质量，g

M——沙枣质量，g

2.3单因素实验

2.3.1料液比考察

称取2.00 g沙枣粉，在乙醇浓度50%、超声功率240 W、超声时间10 min，料液比分别为1:10、1:12、1:14、1:16、1:18、1:20、1:22、1:24(g/mL)的条件下进行单因素实验，确定最佳料液比。

料液比考察结果如图1所示，随料液比的增大黄酮提取率逐渐增大，但当料液比大于1:20 时，黄酮基本提取完全了，故确定最佳料液比为1:20。

图1　料液比对黄酮提取率的影响

2.3.2超声时间考察

在上述最佳料液比、乙醇浓度50%、超声功率240 W、超声时间分别为5 min、7.5 min、10 min、12.5 min、15 min、17.5 min、20 min的条件下进行单因素实验，确定最佳超声时间。

超声时间考察结果如图2所示，随着超声提取时间的增加，黄酮提取率也增加，当提取时间大于12.5 min时，黄酮提取率基本保持不变，为了节约时间及降低成本，所以取最佳超声时间为12.5 min。

图2　超声时间对黄酮提取率的影响

2.3.3乙醇浓度考察

在上述最佳料液比，最佳超声时间，超声功率240 W，乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%、90%的条件下进行单因素实验，确定最佳乙醇浓度。

乙醇浓度考察结果如图3所示，乙醇浓度在40%～60%时，随浓度的增加黄酮提取率逐渐增加，乙醇浓度在 60%～90%时,随乙醇浓度的增加黄酮提取率降低，故确定最佳乙醇浓度为60%。

图3　乙醇浓度对黄酮提取率的影响

2.3.4超声功率考察

在上述最佳料液比，最佳超声时间，最佳乙醇浓度，超声功率分别为160、200、240、280、320、360 W的条件下进行单因素实验，确定最佳超声功率。

图4　超声功率对黄酮提取率的影响

超声功率考察结果如图4所示，在160～320 W，随着超声功率的增加，黄酮提取率也逐渐增加，当功率为320 W时黄酮提取率达最高，但当功率超过320 W后，黄酮提取率没有增加反而降低，说明超声功率达到一定程度时，由于某些黄酮类化合物的热稳定性较差，加热容易分解，导致黄酮提取率降低。故确定最佳超声功率为320 W。

2.4正交实验优选

在单因素试验基础上，以总黄酮提取率为指标，选取乙醇浓度、超声时间、料液比、超声功率为考察因素，采用正交试验[9]优化沙枣中总黄酮的提取工艺条件。因素水平见表1，试验安排及结果见表2。

表1　因素与水平

由表2可知，影响沙枣黄酮提取率的因素从大到小依次为：料液比>超声时间>乙醇浓度>超声功率，最优工艺条件为：A3B3C2D2，即料液比1:22，超声时间15 min，乙醇浓度60%，超声功率320 W。

表2　正交实验结果与分析

2.5最佳工艺验证实验

分别称取2，4，6 g沙枣粉，按优选的工艺条件提取沙枣中总黄酮，提取3次，计算总黄酮提取率分别为8.68%，8.64%，8.60%。说明优选的提取工艺具有较好的重复性，且稳定可行。

2.6沙枣黄酮的抗氧化性能(还原力测定)

取2.5mL不同浓度(0.2～1.0 mg/mL)的试样溶液，分别加入2.5mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH=6.6)和2.5mL 1.0%K3Fe(CN)6溶液，混合均匀后于50℃水浴保温反应20 min后快速冷却。取出后再加2.5mL 10%醋酸溶液混匀，而后在3000 r/min离心10 min。取上清溶液5.0mL加入蒸馏水5.0mL，再加入1.0mL 0.1%的FeCl3溶液，静置10 min后，以蒸馏水做空白，在700 nm处测定吸光度，得到回归方程，Abs=1.9623×C+0.07597(R2=0.99069)。

还原力测定结果如图5所示，随着样液浓度的增加，沙枣黄酮的还原力也相应增加。EC50值(吸光值在0.500时所对应的浓度)为0.216 mg/mL。说明沙枣黄酮具有较好的抗氧化能力。

图5　沙枣总黄酮的还原力

3　结　论

通过单因素试验及正交试验对沙枣中总黄酮的提取研究，确定最佳工艺为:料液比1:22(g/mL)，超声时间15 min，乙醇浓度60%，超声功率320 W，此工艺提取效果最好，提取率达到8.68%。工艺简单易行，安全可靠，提取率高，有利于沙枣资源的合理利用。通过对沙枣总黄酮的还原力测定，表明沙枣总黄酮有较好的抗氧化性能。

[1]王雅,周尚臻,李家寅,等.沙枣功能成分及药理活性研究进展[J].食品工业科技,2013,34(3):361-364.

[2]黄泽元,王海滨,刘志伟.芝麻叶中总黄酮的最佳提取工艺研究[J].农业工程学报,2004,20(6):201-204.

[3]王晖,刘佳佳.银杏黄酮的酶法提取工艺研究[J].中药材,2003,26(12):887-888.

[4]王基云,姚遥,肖旭,等.沙枣花黄酮成分的含量测定及其药理作用的初步研究[J].时珍国医国药,2010,21(4):812-814.

[5]王凯.宁夏沙枣中总黄酮的提取工艺研究[J].安徽农业科学,2011,39(14):8343-8344,8347.

[6]张勇,李彩霞,李鹏,等.醇法提取锁阳中总黄酮的研究[J].甘肃科学学报,2005,17(1):41-43.

[7]黄仁术,胡晓梦,何惠利.大别山野葛根异黄酮超声辅助提取工艺的响应面优化与还原力测定[J].中国药学杂志,2015,50(2):51-57.

[8]王军,王敏,季璐.苦荞麦麸皮总黄酮提取工艺及其数学模型研究[J].农业工程学报,2006,22(7):223-225.

[9]耿红梅,张彦,曹丽慧,等.正交实验优选白花菜子总黄酮的最佳提取工艺[J].时珍国医国药,2012,23(04):886-887.

Optimization of Extraction Process for Total Flavonoids from Elaeagnus angustifolia

WANG Hong-yu,BEN Lian-fang,WANG An-qi,ZHANG Hai-liang

(Lanzhou Petrochemical College of Vocational Technology,Gansu Lanzhou 730060,China)

To optimize extraction conditions of extracting total flavonoids from Elaeagnus angustifolia and preliminarily investigate antioxidant activity of flavonoids by measuring restoring force,with the extraction efficiency of total flavonoids as index,the effects the concentration of ethanol,ultrasonic time,solid-liquid ratio and ultrasonic power exerted on yield of total flavonoids extracted from Elaeagnus angustifolia were investigated by the single-factor test.Based on the single factor test,extraction technology of extracting total flavonoids from Elaeagnus angustifolia was optimized through orthogonal test.The optimum extraction technology conditions were as follows：alcohol concentration of 60%,ultrasonic time 15 min,solid-liquid ratio 1:22 (g/mL),ultrasound power 320 W.Under these conditions,the yield of total flavonoids reached to 8.64%.The main factors that influenced the flavonoid extraction rate were listed in descending order as follows:solid-liquid ratio>ultrasonic time>alcohol concentration>ultrasonic power.The restoring force measuring results showed that Elaeagnus angustifolia possessed excellent antioxidant activity.

Elaeagnus angustifolia; total flavonoids; extraction technology; antioxidant activity

王红玉(1987-)，女，助教，从事石油化工生产技术方面的教学和研究工作。

R284.2

B

1001-9677(2016)011-0123-03