基于COI和18SrRNA基因对蜚蠊物种进行分子鉴定*

陈壮志，杨志斌,3，李贵轲，刘　衡,3，陈　丹，高鹏飞,3，张成桂,3

(1 云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南　大理　671000；2 中国西南药用昆虫及蛛形类资源开发利用协同创新中心，大理大学，云南　大理　671000；3 药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心，云南　大理　671000；4 四川好医生药业集团有限公司，四川　成都　615000)



分析测试

基于COI和18SrRNA基因对蜚蠊物种进行分子鉴定*

陈壮志1,2，杨志斌1,2,3，李贵轲3,4，刘衡1,2,3，陈丹1,2，高鹏飞1,2,3，张成桂1,2,3

(1 云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理671000；2 中国西南药用昆虫及蛛形类资源开发利用协同创新中心，大理大学，云南大理671000；3 药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心，云南大理671000；4 四川好医生药业集团有限公司，四川成都615000)

为从分子水平上明确药用美洲大蠊在分类学上的地位，采用分子克隆和序列比对的方法，对云南大理产美洲大蠊的COI基因和18SrRNA基因片段进行扩增、克隆和序列测定，并同蜚蠊科相关物种进行系统发育分析。结果表明，通过邻接法(Neighbor-joining method, NJ)和最小进化法(Minimum evolution method, ME)构建的系统树基本一致，证实COI能对美洲大蠊及其近缘物种进行有效的物种分子鉴定，而18SrRNA不能进行有效的分子鉴定。

美洲大蠊；COI基因；18SrRNA基因；系统进化分析

美洲大蠊(Periplanetaamericana)为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”，是我国重要的传统药材，其入药始载于《神农本草经》，并把它列为中品，谓“味：咸、寒；治：血瘀症坚寒热、破积聚、喉咽闭、内寒无子”。美洲大蠊具有多种药理作用，比如如抗肿瘤、改善微循环、强心升压、抗菌及抗病毒作用和促进组织修复等[1]。传统的药用美洲大蠊分类研究主要以形态学为依据，但由于药用美洲大蠊炮制品大多残缺不全，容易混入伪品，给准确的药材鉴定带来许多困难。DNA条形码方法由于不受样品形态的限制，弥补了昆虫药材在形态鉴定上的缺陷，是形态学鉴定美洲大蠊以有力的补充，可更加准确有效地鉴定昆虫药材炮制品[2-4]。

本研究利用线粒体COI基因和细胞核18SrRNA基因，对药用美洲大蠊及其近缘物种等6种蜚蠊的这两个基因序列特征进行分析，并对它们分子分类的有效性进行比较和探讨，为美洲大蠊药材的准确分类提供依据。

1　实　验

1.1样品采集

本研究共收集云南省大理州大理大学昆虫医药研究院作邑养殖基地产美洲大蠊实验样本5个。实验样本均根据《中国动物志》及《中国药典》，经大理大学杨自忠教授进行鉴定。

1.2基因组DNA提取

取单个美洲大蠊约50 mg的胸部肌肉，采用SDS-蛋白酶K消化，酚-氯仿抽提和乙醇沉淀法提取总DNA[5]提取的 DNA置于-20 ℃保存。

1.3PCR扩增

COI基因、18SrRNA基因的引物序列设计分别参照Vrijenhoek[6]和Tautz等[7]的研究。COI基因的引物序列为:LCO1490 5’-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3’，HCO2198 5’-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3’；18SrRNA基因的引物序列为：18S-ai 5’-CCT GAG AAA CGG CTA CCA CAT C-3’，18S-b0.5 5’-GTT TCA GCT TTG CAA CCA T-3’。引物均由上海生工生物工程有限公司合成，PCR扩增在MyCycler Thermal Cycler 型PCR仪(美国Bio-Rad公司)上进行。反应体积为50 μL，包含2×Taq PCR MasterMix 25 μL(天根生化科技(北京)有限公司)，10 μmol/L引物LCO1490、HCO2198或18S-ai、18S-b0.5各1 μL，模板DNA约50 ng，灭菌ddH2O补足至终体积。PCR反应程序为：扩增条件依次为：94 ℃预变性3 min；35个循环的94 ℃变性45 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min；72 ℃延伸7 min；4 ℃保温。同时以灭菌ddH2O代替模板DNA作阴性对照。取2 μL PCR产物上样至1.2%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/mL EB)电泳检测，其余置-20 ℃冰箱保存备用。对于扩增无杂带，目的条带明亮的PCR产物送交上海生工生物有限公司测序。COI基因采用双向测序、测序引物为LCO1490、HCO2198，18SrRNA基因则采用单向测序，测序引物为18S-ai、18S-b0.5。

1.4序列分析和数据处理

用DNASTAR软件包中的SeqMan软件对获得的基因序列进行校对和编辑,并在美国生物信息中心(NCBI)网站的Genbank中搜寻最相关序列，选取蜚蠊科及用于做外群昆虫的相应序列(表1)，借助在线Clustal W(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)[8]进行对位排列。运用MEGA 5.2软件，根据Kimura 2-parameter模型分别构建NJ(Neighbor-joining)和ME(Minimum evolution)系统进化树，采用Bootstrap(重复数=1000)检验分子系统树各分支的置信度。

表1　6种蜚蠊目昆虫Genbank序列号Table 1　GenBank Numbers of the CO I and 18S rRNAsequences of Blattaria

续表1

蜚蠊科Blattidae东方蜚蠊BlattaorientalisAM114926.1AY521830.1侧缘雪蠊ShelfordellalateralisJQ267493.1DQ874114.1姬蠊科Blattellidae德国小蠊BlattellagermanicaJQ350728.1DQ874114.1

2　结果与讨论

2.1COI和18SrRNA基因序列特征

通过美洲大蠊总DNA的PCR扩增、测序，分别得到5个美洲大蠊清晰单一的COI基因、18SrRNA基因片段扩增产物，5个美洲大蠊个体的COI基因和18SrRNA基因序列测定结果完全相同。与蜚蠊科其他5种昆虫序列比对，分别选取COI和18SrRNA基因序列中没有任何碱基插入、缺失的602 bp和751 bp(分别编码和250个氨基酸)的序列片段进行分析。其中COI基因有140个变异位点、84个简约信息位点、462个不变位点，分别占分析序列碱基的23.26%，19.95%，76.74%。18SrRNA基因有2个变异位点、0个简约信息位点、748个不变位点，分别占分析序列碱基的0.27%，0，99.60%。可变位点、简约信息位点的百分比COI均要高于18SrRNA基因。

蜚蠊科6种昆虫COI和18SrRNA基因平均GC含量特征有很大不同，分别为34.87%和53.35%，COI基因中GC含量低于AT的平均百分含量(65.13%)，表现出线粒体蛋白编码基因的明显偏倚性。18SrRNA基因密码子各位点的平均GC含量为第二位最高、第一位最低，但COI基因第一、二和三密码子位点的平均GC含量均低于18SrRNA基因的相应位点。黑胸大蠊第3位GC含量(8.50%)在蜚蠊科6种昆虫的2种基因中均是最低的(表2)。

表2　蜚蠊科6种昆虫CO I、18S rRNA基因序列片段平均GC含量Table 2　The GC average contents of CO I and 18S rRNA gene sequences for 6 species in the order Blattidae 　(%)

续表2

东方蜚蠊Blattaorientalis34.3947.7644.2811.0053.4751.0056.0053.41侧缘雪蠊Shelfordellalateralis36.2146.7744.7817.0053.3350.6056.0053.41平均值(Meanvalue)34.8747.4644.7312.3053.3550.6456.0053.41

所有个体COI和18SrRNA基因序列变异位点信息见表2。相同对百分比在COI和18SrRNA基因序列中均为90%以上，18SrRNA基因中更是高达99.87%，密码子第3位的相同对百分比均最低，而第1、2位非常近似；对于COI基因转换和颠换多出现在密码子的第3位和第1位，其颠换100%来自第3位密码子，而18SrRNA基因序列中没有转换位点和颠换位点(表3)。

表3　蜚蠊科6种昆虫CO I和18S rRNA基因序列片段各密码子位点碱基变异表Table 3　The sequence variation of the CO I and 18S rRNA genes for 6 species in the order Blattidae

注: “/”的前者为数值，后者为百分比。

2.2遗传距离

种间和种内遗传距离大小是物种判定的主要标准。基于COI基因序列的美洲大蠊与其余5种蜚蠊科昆虫种间遗传距离(表4)在0.102～0.164之间，美洲大蠊种内遗传距离在0～0.020之间，前者均大于后者。基于18SrRNA基因序列的美洲大蠊与其余5种蜚蠊科昆虫种间遗传距离(表5)在0～0.003之间，美洲大蠊种内遗传距离在为0，前者与后者有遗传距离的重叠。COI种间遗传距离均显著高于Hebert等[9]设定的2%的遗传差异。

基于COI和18SrRNA基因序列最大种间遗传距离均发生在棕色大蠊与侧缘雪蠊之间(0.164)以及东方蜚蠊和其他5种蜚蠊之间(0.003)。美洲大蠊基于COI基因序列种内平均遗传距离(0.012)高于18SrRNA基因序列(0)。

表4　蜚蠊科6种昆虫基于CO I基因序列遗传距离Table 4　Genetic distances of 8 species in the order Blattidae based on CO I gene

表5　蜚蠊科6种昆虫基于18S rRNA基因序列遗传距离Table 5　Genetic distances of 8 species in the order Blattidae based on 18S rRNA gene

续表5

6澳洲大蠊Periplanetaaustralasiae0.0000.0000.0000.0000.0007黑胸大蠊Periplanetafuliginosa0.0000.0000.0000.0000.0000.0008棕色大蠊Periplanetabrunnea0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0009东方蜚蠊Blattaorientalis0.0030.0030.0030.0030.0030.0030.0030.00310侧缘雪蠊Shelfordellalateralis0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.003

2.3分子系统进化分析

将获得的美洲大蠊CO I基因和18S rRNA基因序列，以姬蠊科昆虫德国小蠊为外群，分别用于对美洲大蠊及其近缘物种分别进行聚类分析，得到CO I基因和 18S rRNA 基因片段的NJ和ME系统进化树(图1、图2)。

基于CO I基因构建的NJ和ME两种系统树的拓扑结构基本一致，只是两树的自举置信水平稍有不同。在两种系统树中，美洲大蠊5个体首先相聚,再与同为大蠊属的澳洲大蠊、黑胸大蠊和棕色大蠊聚合。基于18S rRNA基因序列构建的NJ和ME两种系统树的拓扑结构也基本一致，也是两树的自举置信水平稍有不同。在两种系统树中，美洲大蠊5个体与澳洲大蠊、黑胸大蠊、棕色大蠊和侧缘雪蠊聚合，自举置信水平也较高(88)，说明利用18S rRNA基因序列不能对美洲大蠊及其近缘物种进行有效分类鉴定。

图1　基于CO I基因序列构建蜚蠊目7种昆虫Neighbor-Joining树

图2　基于18S rRNA基因序列构建蜚蠊目7种昆虫Neighbor-Joining树

3　结　论

对蜚蠊科6种昆虫CO I和18S rRNA基因序列比较分析发现，由于CO I基因序列为线粒体基因，18S rRNA为核基因，所以两种序列存在较多差异性，如:(1)CO I基因序列GC的百分含量较低，表现出明显的反GC偏倚，而18S rRNA基因中则没有这种偏倚(在CO I和18S rRNA中GC的百分含量分别为34.87%和53.35%)，CO I的碱基含量分布为典型的昆虫线粒体基因特征[10]；(2)CO I基因的变异位点较多，而18S rRNA基因的基本无变异位点，简约信息位点也是CO I较多，而在18S rRNA中未发现简约信息位点，由此导致美洲大蠊与澳洲大蠊、黑胸大蠊、棕色大蠊和侧缘雪蠊种内种间遗传距离相近而无法区分。但CO I、18S rRNA基因也存在一些相似点：(1)相同对百分比在CO I和18S rRNA基因序列中均为90%以上；(2)在CO I和18S rRNA基因序列中，相同对在第1、2和3位密码子中所占比例相似。通过以上分析可知变异位点、简约信息位点百分含量在不同基因、不同类别间存在差异，在本研究中，CO I较18S rRNA基因的变异率更高些，而18S rRNA基因基本无变异。

CO I基因和18S rRNA基因在生物体内含量较大且在进化过程中较保守，是探讨生物高级分类群系统演化的难得工具，近年来广泛应用于昆虫分类及系统进化研究[11-16]。本课题首先测定了美洲大蠊其CO I基因、18S rRNA基因序列，结果表明它们与GenBank上已发表的美洲大蠊相应基因的相似性达98%以上。CO I基因基因片段的保守性强，同属内各种之间差异较大，种内基本无遗传变异，适用于美洲大蠊和蜚蠊科其他5种昆虫的分类鉴定和系统进化分析；18S rRNA基因片段的保守性更强，种内和同属各种之间差异基本为0，种内种间基本无遗传变异，故18S rRNA不能对美洲大蠊及其近缘物种进行分类鉴定和系统进化分析。

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The Molecular Species Identification of Blattaria Based on mtDNACOIand 18SrRNAGene Sequences*

CHEN Zhuang-zhi1,2, YANG Zhi-bin1,2,3, LI Gui-ke3,4, LIU Heng1,2,3, CHEN Dan1,2,GAOPeng-fei1,2,3,ZHANGCheng-gui1,2,3

(1 Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D, Yunnan Dali 671000;2 Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics, Dali University, Yunnan Dali 671000;3 The National-Local Joint Engineering Laboratory for Entomoceutics, Yunnan Dali 671000;4 Gooddoctor Pharmaceutical Group, Sichuan Chengdu 615000, China)

COIand 18SrRNAgenes ofPeriplanetaamericanacollected at Dali, Yunnan Province were cloned and sequenced. The phylogenetic relationships between thePeriplanetaamericanaand its closely related 5 species in the order Blattaria were analyzed. The results showed that the phylogenetic trees were almost identical with methods of NJ (Neighbor-joining) and ME (Minimum evolution). It showed thatCOIgene was a practical molecular marker for species identification ofPeriplanetaamericanaand its closely related species, while 18SrRNAgene failed to be used in species identification.

Periplanetaamericana;COIgene; 18SrRNAgene; phylogenetic analysis

国家自然科学基金(81360679)；云南省战略性新兴产业项目发展专项资金([2013]1527)；云南省高新技术产业发展重点项目([2012]1956)；云南省2011协同创新中心项目([2012]25)。

陈壮志(1987-)，男，在读硕士研究生，研究方向为分子生物学和生物信息学。

张成桂，男，副教授、博士，主要研究方向为分子生物学和生物制药研究。

TQ460

A

1001-9677(2016)013-0104-05