响应曲面法优化赤芝多糖提取工艺的研究*

叶　芳，李伟建，徐永群，李鹤祥，吴泽霞

(韶关学院化学与环境工程学院，广东　韶关　512000)



响应曲面法优化赤芝多糖提取工艺的研究*

叶芳，李伟建，徐永群，李鹤祥，吴泽霞

(韶关学院化学与环境工程学院，广东韶关512000)

在单因素试验基础上，根据 Box-Behnken的中心组合实验设计原理采用三因素三水平的响应面分析法，以水料比、提取时间和提取温度为自变量，多糖提取率为响应值，研究各自变量及其交互作用对多糖提取率的影响。结果表明赤芝多糖浸提的最佳条件为：水料比为50:1，提取时间为2.5 h，提取温度为75 ℃，在此条件下多糖提取率达到0.199%，与预测的理论值0.204%相差不大，说明采用响应面分析法优化工艺所得到的提取条件参数可靠，此法具有一定的应用价值。

赤灵芝；多糖；响应面；响应值

灵芝中含有的灵芝多糖因其具有抗肿瘤、提高机体免疫、耐缺氧能力、消除体内自由基、抗辐射、提高肝脏解毒功能、降血糖、降血脂等作用，而被认为是灵芝药用的主要有效成分[1-4]。而影响灵芝多糖提取率的因素很多，如提取溶剂的选择、提取温度、提取时间及水料比等，提取的最佳工艺必须经过大量试验进行探索才能得到。目前大多数赤灵芝中多糖的提取工艺的优化采用的是正交试验方案，实验次数较多，然而本实验中的响应曲面法采用了数学统计和模型结合的方法，能够以最经济的方式、用很少的试验数量和时间对实验行全面研究，最终优化出赤芝中多糖的浸提工艺。

1　实　验

1.1材料与仪器

赤灵芝(市场购买)；无水葡萄糖、浓硫酸、蒽酮与无水乙醇均为分析纯。

超级恒温水浴(HK-2A型)，南大万和科技有限公司；旋转蒸发仪(R501型)，上海雅荣生化仪器设备有限公司；紫外-可见光分光光度计(UV-759)，上海精密科学仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1标准曲线的绘制[5-6]

准确称量0.1 g蒽酮，溶解于100 mL 80%的硫酸中，摇匀，保存于棕色瓶中，当日配制使用，即得1 g·L-1的硫酸蒽酮溶液。

准确称取干燥至恒重的葡萄糖10.00 mg，加少量水溶解转移到100 mL的容量瓶中并稀释至刻度线，摇匀，即得0.1 mg·mL-1的葡萄糖标准溶液。精确移取葡萄糖标准溶液0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL，分别置于25 mL比色管中，分别加入蒸馏水补至2.0 mL，然后再加入6.00 mL硫酸蒽酮溶液，摇匀后放入80 ℃水浴加热15 min后取出，置于冷水中冷却至室温，同时用2.00 mL蒸馏水与6.00 mL 硫酸蒽酮混合溶液作为空白，用紫外-可见分光光度计在波长为625 nm处测量吸光度A，得标准曲线方程A=41.49c，相关系数R2=0.9992。

1.2.2多糖提取方法[7]

取1 g粉碎后的灵芝粉末，根据一定的水料比加入蒸馏水，在设定的温度和时间条件下加热。加热完成后抽滤得多糖提取液，将多糖提取液减压蒸发，定容至25 mL，摇匀。准确量取5.00 mL溶液至25 mL的比色管中，加入无水乙醇至刻度线，摇匀，4 ℃下放置15 h，取出，离心，弃去上层清液，沉淀加水溶解，并转移至25 mL的比色管，加水稀释至刻度，摇匀即得样品溶液。

1.2.3多糖含量的测定方法[8-9]

准确量取2.00 mL样品溶液，加入1 g·L-1硫酸蒽酮溶液6.00 mL，摇匀后放入80 ℃水浴加热15 min，置于冷水中冷却至室温，用紫外-可见分光光度计于625 nm波长处测其吸光度A，根据标准曲线查出多糖的浓度c，根据下式即可计算出样品中灵芝多糖的提取率。

式中：c——多糖浓度，mg·mL-1

ms——样品质量

2　结果与讨论

2.1水浸提灵芝多糖过程中的单因素影响

2.1.1水料比的影响

灵芝浸提多糖过程中的加水量是限制多糖提取率的重要因素，图1是水料比对灵芝多糖提取率影响的关系图。从图1可知，在温度为80 ℃，加热时间为2 h的条件下，随着水料比(mL·g-1)的增加，多糖提取率开始增加，直到水料比(mL·g-1)超过50:1以后，再继续增加水料比发现灵芝多糖的提取率反而减少，所以选择50:1附近作为适宜的水料比。

图1　水料比对多糖提取率的影响

2.1.2提取时间的影响

在温度为80 ℃，水料比为50:1，提取时间分别为0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h的条件下考察提取时间对多糖提取率的影响(图2所示)。由图2可知，随着提取时间的增加，多糖提取率明显增加，当提取时间超过2 h以后，灵芝多糖的提取率反而减小。这表明，多糖的浸出过程与时间密切相关，时间过短则多糖溶解不充分，但时间过长则可能会引起产物结构的变化进而使多糖提取率降低，所以选择2 h附近作为适宜的提取时间。

图2　提取时间对灵芝多糖提取率的影响

2.1.3提取温度的影响

图3是在水料比为50:1，提取时间为2 h，提取温度分别为45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃、85 ℃、95 ℃的条件下，考察提取温度对灵芝多糖提取率的影响。从图3可知，随着温度增加，灵芝多糖的提取率逐渐增加，但是当超过温度75 ℃以后，多糖的提取率的增加趋于平缓，考虑到高温可能对多糖的结构与活性有一定影响，温度过高多糖易产生降解，而且温度过高，水分容易挥发，给操作带来不便，所以选择在75 ℃附近作为提取的适宜温度。

图3　提取温度对多糖提取率的影响

2.2响应曲面法对灵芝多糖提取工艺的优化

2.2.1响应面因素水平设计

根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，综合单因素实验结果，选取水料比(A)，提取时间(B)和提取温度(C)三因素为自变量，多糖的提取率为响应值Y，并以1，0，-1代表自变量的高、中、低水平，设计三因素三水平试验，见表1。

表1　响应面试验因素水平表Table 1　Factors and levels of responsive surface analysis test

2.2.2响应面法分析方案及结果

根据Box-Behnken中心组合试验方案进行3因素3水平试验，以多糖提取率为指标，研究各因素间相互作用下的灵芝多糖提取率，实验结果见表2。

表2　响应面试验方案及试验结果Table 2　Program and results of responsive surface analysis test

采用Design-Expert8.0统计分析软件对表 2 中的试验数据进行回归拟合，得到水料比(A)，提取时间(B)和提取温度(C)三个自变量与多糖提取率(Y)之间的二次多元回归方程为:

Y=-5.49216+0.12895A-2.01607B+0.14479C+0.092283AB-3.40261AC-1.70650BC-1.40255A2-0.028329B2-4.02482C2

从表3中对上述二次多元方程的方差分析，可以看出，该试验回归模型达到极显著水平(P=0.0003<0.01)，失拟项不显著(P>0.05)，因此，可以应用此回归模型充分表明各因素之间的关系。

同时，从表3结果可知一次项中，水料比(A)，提取时间(B)和提取温度(C)对多糖提取率均具有显著性影响，各因素对多糖提取率影响显著性排序为：提取时间(B)>水料比(A)>提取温度(C)。

表3　回归方程方差分析Table 3　Results of extraction regression analysis

续表3

C214.2634.26358.550.0006残差57.2813.641失拟值11.4301.4302.590.1829净误差45.5262.210校正值163.527

根据二次回归方程绘制各影响因素之间的响应面图，见图4～图6，从各响应面的最高点可以看出，在所选的范围内存在极值，响应曲面上存在最高点。各影响因素之间，提取时间与与提取温度的交互作用较显著，其中水料比与与提取温度之间的交互作用更显著，表现为曲线更为陡峭陡峭，而水料比与提取时间之间的交互作用不具有显著性(P>0.05)，表现为曲线比较平滑，响应值变化较小。根据所建立的数学模型进行工艺参数最优化分析，得到多糖提取的最佳工艺条件: 水料比为50:1，提取时间为2.5 h，提取温度为75 ℃，多糖提取模型的预测值为0.2040%。

图4　水料比和提取时间对多糖提取率影响的响应曲面

图5　水料比和提取温度对多糖提取率影响的响应曲面

图6　提取时间和提取温度对多糖提取率影响的响应曲面

根据上述试验结果进行证性试验，在水料比为50:1，提取时间为2.5 h，提取温度为75 ℃进行了3次平行实验，实际测得赤灵芝多糖平均提取率为0.2012%，相对误差为1.37%，说明试验模型设计所得的最佳工艺参数具有可靠性。

3　结　论

运用响应面分析法优化了赤灵芝多糖的提取工艺，从而求得赤灵芝多糖水浸提的最佳工艺条件为: 水料比为50:1，提取时间为2.5 h，提取温度为75 ℃，此时赤灵芝多糖的提取率达到0.2012%。

[1]方一苇.具有药理活性多糖的研究现况[J].分析化学,1994,22(9):955-960.

[2]李明春,梁东升,许自明,等.灵芝多糖对小鼠巨噬细CAM P 含量的影响[J].中国中药杂志, 2000,25(1):41-43.

[3]金春华,姜秀莲,王英军,等.灵芝多糖活血化瘀作用实验研究[J].中草药,1998,29(7):470-472.

[4]李容芷.从灵芝扶正固本有效成分灵芝多糖的发现讨论中药活性研究的方法途径[J].北京医科大学学报,1987,119(6):431.

[5]陈勇,徐永群,彭翠红,等.荧光光谱法测定灵芝多糖的含量[J].分析科学学报,2012,28(3): 411-413.

[6]刘敏,高岚.紫外分光光度法测定灵芝孢子粉胶囊中灵芝多糖含量[J].现代中医研究与实践, 2005,19(4):34-35.

[7]王莹,王华,丁宁,等.响应曲面法优化水溶性银杏叶多糖提取工艺[J].江苏农业科学,2015, 43(5):268-270.

[8]董艳红,李姝婧,郑惠华,等.响应曲面优化超声波提取灵芝多糖工艺研究[J].食品科学,2009, 30(16):98-101.

[9]刘军海,黄宝旭,蒋德超.响应面分析法优化艾叶多糖提取工艺研究[J].食品科学,2009, 30(2):114-118.

Study on Optimization of Extraction Technology of Polysaccharide from Ganoderma Lucidum by Response Surface Methodology*

YE Fang, LI Wei-jian, XU Yong-qun, LI He-xiang, WU Ze-xia

(College of Chemical and Environment Engineering, Shaoguan University, Guangdong Shaoguan 512005, China)

Based on single factor tests, the optimum extraction conditions of polysaccharides from ganoderma lucidum were obtained through Box-Benhnken central combination design with three factors and three levels response surface methodology(RSM). Taking the ratio of water to material, extraction time and extraction temperature as independent variables, and the extraction rate of polysaccharide as the response value, the effects of their respective variables and their interaction on the extraction rate of polysaccharides were studied. The results showed that the optimum conditions for extracting ganoderma lucidum polysaccharide were the ratio of water to material of 50:1, the extracting time of 2.5 h, extraction temperature of 75 ℃, under the condition, the yield of polysaccharide was up to 0.199%, which was very closely to 0.204% of prediction. The method of response surface analysis was used to optimize the extraction condition parameters, which had a certain application value.

ganoderma lucidum; polysaccharide; response surface; response value

2015年韶关学院大学生创新项目(NO: sycxcy2015-128)。

叶芳(1983-)，女，主要从事电化学方面的研究。

O658.9

A

1001-9677(2016)013-0078-04