蓬子菜中香叶木苷抗血栓作用研究

隋文霞，董　坤，万晓晨，寇韩旭，马英丽

(1.黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨150040；2.黑龙江省中医药科学院，哈尔滨150036)



蓬子菜中香叶木苷抗血栓作用研究

隋文霞1，董坤2，万晓晨1，寇韩旭1，马英丽1

(1.黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨150040；2.黑龙江省中医药科学院，哈尔滨150036)

为研究蓬子菜活性成分香叶木苷改善血液流变学异常和抗静脉血栓作用，通过结扎大鼠下腔静脉造成下肢静脉血栓模型，通过检测血液流变学指标，以及观察下腔静脉在透射电镜下的组织学变化，考察香叶木苷对血栓大鼠血液流变学和内皮功能的影响.结果表明，与模型组相比，蓬子菜中香叶木苷能明显改善血栓大鼠血液流变学指标，并可有效改善下腔静脉内皮细胞功能.蓬子菜活性成分香叶木苷具有改善血液流变学异常和抗静脉血栓形成的作用.

蓬子菜；香叶木苷；静脉血栓；血液流变学

蓬子菜(Galium verum L.)，是茜草科(Rubiaceae)拉拉藤属(Galium)药用植物蓬子菜的干燥全草[1].蓬子菜在民间拥有广泛的药用基础，常被用于治疗静脉系统疾病，并已取得良好的临床疗效[2].蓬子菜主要含黄酮类成分，包括香叶木苷(Diosmin)、喇叭茶苷(Palustroside)、芸香苷(Rutin)等.据研究表明，香叶木苷(Diosmin，3′，5，7-三羟基4′-甲氧基黄酮-7-芸香苷)是蓬子菜治疗静脉系统疾病的主要活性成分，能防止静脉血管壁损伤，可降低静脉通透性，增加静脉张力，改善微循环，抗静脉血栓形成[3].本实验以香叶木苷药理作用为基础，通过对血栓大鼠血流变参数的测定，观察其对血液流变学的影响，证明香叶木苷具有降低血液黏度，抑制红细胞聚集，抑制血栓形成的作用；同时，应用透射电镜观察静脉血管组织形态学变化，证明香叶木苷可保护血管内皮细胞功能，从而发挥抗静脉血栓形成的作用.

1　材料

1.1实验动物

Wistar大鼠，雄性，体重200～300g，购于黑龙江中医药大学实验动物中心(合格证号：SCXK2009-0002).

1.2药品与试剂

香叶木苷(C28H32O15)，质量分数≥90%( HPLC)，本实验室自提阿司匹林片(济南永宁制药股份有限公司)，水合氯醛(天津市科密欧化学试剂有限公司).

1.3仪器

全自动血液流变测试仪(Z30，南京志伦科技有限公司)，全自动血沉仪(Roller20，北京现代威士达医疗器械有限公司)，离心机(KDC-160HR，安徽中科中佳科学仪器有限公司)，切片机(LEICAULTRACUTUCT德国)，透射电镜(TECNAIG荷兰).

2　方法

2.1分组与给药

Wistar大鼠，雄性，平均体重250g，随机分成6组，每组10只.给药剂量参考陈奇主编《药理试验方法学》[4]，根据人的临床给药剂量进行换算.分别为：空白组、模型组，灌胃生理盐水；香叶木苷低剂量组：45mg/kg/d；香叶木苷中剂量组：90mg/kg/d；香叶木苷高剂量组：180mg/kg/d；阿司匹林组：15mg/kg/d.均采用灌胃给药，每日一次，按剂量连续给药7 d.

2.2造模方法

用10%水合氯醛对大鼠进行麻醉，将麻醉后的大鼠仰卧位固定，根据Reyers[5]法，于腹中线剑突下方切开皮肤3 cm，剖开腹腔，将肠管移出体外，以浸满生理盐水的纱布覆盖肠管.找出下腔静脉，仔细分离下腔静脉主干和左肾静脉汇合处，用非吸收性丝线结扎下腔静脉主干，将肠管移回腹腔内，并依次缝合腹壁及皮肤.术后将大鼠放入笼中单独饲养.取材前12 h禁食不禁水.

2.3取材方法

2.3.1取静脉血

将麻醉后的大鼠仰位固定，剖开缝合处腹腔及腹膜，找到下腔静脉，在结扎线上方血管充盈处采集静脉血4 mL.并观察血管内是否有血栓形成.

2.3.2取静脉血管

仔细分离下腔动、静脉血管，剥离静脉血管.剥离干净后，用止血钳夹住结扎线上方血管，取血管约2cm，用生理盐水进行冲洗.将所取静脉截下适当长度，放入2.5%戊二醛溶液中进行固定.

2.3.3制备透射电镜切片

按取材—漂洗(生理盐水)—前固定(2.5%戊二醛，4 ℃冰箱2 h以上)—漂洗(0.1 mol/L磷酸缓冲液洗3次，共45 min)—后固定(1%锇酸1 h左右)—漂洗(0.1 mol/L磷酸缓冲液洗3次，共45 min)—梯度脱水—渗透—包埋—聚合—修块—切片—载网—染色(饱和醋酸铀染色30 min，枸橼酸铅染色5～8 min)顺序制备透射电镜切片.

2.4检测方法

2.4.1血流变指标检测

将处理后的样本放入血液流变测试仪、全自动血沉仪检测全血粘度、血浆粘度及血沉等.

2.4.2电镜组织学观察

用透射电镜对各组静脉样品切片进行观察并摄片.

3　统计方法

数据均用平均值±标准误(x±S)表示，采用SPSS19.0 for Windows统计分析软件分析处理.P<0.05有显著性差异，P<0.01有极显著性差异.

4　结果

4.1蓬子菜中香叶木苷对血液流变学的影响

结果见表1、2.模型组血流变参数均发生显著性变化，证明造模成功.而香叶木苷各组均能不同程度降低全血黏度、血浆黏度、红细胞压积、血沉及红细胞聚集和变形指数，能有效改善血瘀模型大鼠血液流变学，抑制血细胞聚集.

表1　香叶木苷对全血黏度及血浆黏度的影响±S)

注：与模型组比较：**P<0.01，*P<0.05；与空白组比较：△△P<0.01，△P<0.05

表2　香叶木苷对红细胞压积、血沉及红细胞聚集指数的影响±S)

注：与模型组比较：**P<0.01，*P<0.05；与空白组比较：△△P<0.01，△P<0.05

4.2电镜组织学观察结果

空白组：见图1，可见内皮细胞结构完整，线粒体轮廓清晰，嵴结构完整并可见粗面内质网，同时可见正常结缔组织.模型组：见图2，内皮外可见血栓，内皮细胞不连续，可见内皮细胞脱失、融合，尚未脱落的内皮细胞膜系结构不清晰，核周隙由于细胞核缩小而变宽；线粒体空泡变性、肿胀、嵴消失，内质网扩张，脱颗粒.

香叶木苷低剂量组：见图3，内皮细胞较连续，线粒体膜结构不清晰，嵴断裂，呈空泡状，胞浆内可见体积较小的新生线粒体，溶酶体增多.

香叶木苷中剂量组：见图4，管腔内无血栓，内皮细胞较连续，损伤情况减轻，没有明显的脱失；线粒体核膜完整，内嵴结构较清晰，有粗面内质网和核糖体.

香叶木苷高剂量组：见图5，血管腔内无血栓，内皮结构完整连续，线粒体轮廓清晰，膜完整可见，未见空泡状.

阿司匹林组：见图6，内皮细胞结构较完整，结缔组织正常，核膜曲度较模型组减小，管腔内可见红细胞，线粒体膜较完整，嵴结构完整，有吞云小泡.

图1　空白组

图2　模型组

图3　香叶木苷低剂量组

图4　香叶木苷中剂量组

图5香叶木苷高剂量组

图6　阿司匹林组

5　讨　论

静脉血流瘀滞、高凝状态和静脉壁损伤是下肢静脉血栓形成的三大主要原因[6]，所以应从改善血流缓滞及高凝状态，降低静脉壁损伤程度和保护静脉血管内皮细胞功能等方面对静脉血栓疾病进行预防和治疗.本实验采用结扎下腔静脉的方法进行造模，造模成功后可引起局部血流瘀滞，同时造模所导致的炎症和缺氧状态可引起血管内皮损伤，影响其抗血栓和促纤溶作用，促进血小板聚集，导致血栓形成[7].

在正常情况下，机体的凝血与抗凝血功能是动态平衡的，在维持平衡的过程中，血液流变学起到重要作用[8].由实验结果可知，香叶木苷可有效改善血栓大鼠血液流变学异常，通过改善血液的流动性、变形性、凝固性防治血栓形成.

通过进行电镜组织学观察，可表明香叶木苷各剂量组均能改善血管内皮功能，具有抗静脉血栓形成作用.同时，香叶木苷高剂量组血管腔内无血栓，内皮结构较完整连续，线粒体轮廓清晰，膜完整可见，未见空泡状，其作用优于低、中剂量组，与血液流变学检测结果一致.

[1]马英丽,卢卫红, 崔明宇, 等.蓬子菜药材HPLC指纹图谱研究[J].中草药,2006,37(11):1723-1726.

[2]高杰,赵钢,李令根, 等. 康脉2号胶囊治疗下肢深静脉血栓形成98例[J]. 现代中西医结合杂志,2009,18(3):259-260.

[3]苏秀丽.香叶木苷调控血栓靶蛋白的研究[D].哈尔滨:哈尔滨工业大学,2012.

[4]陈奇.药理试验方法学[M].北京:人民卫生出版社,2006. 1168-1170.

[5]REYERS I, MUSSONI L, KONATIi MB,etal. Failure of aspirin at different doses to modify experimental thrombosis in rats[J]. Thromb Res,1980, 18(5): 669-674.

[6]RUTHERFORD R B,RUTHERFORD M D. Vascular Surgery[M].5th ed.北京:人民卫生出版社,2002,192058.

[7]GERRYA F, DAHLBACKB. Factor V and thrombotic disease: description of a Janus faced protein [J]. Arterioscler Thromb Vascbiol, 2009, 22 (4): 530-538.

[8]CRISTINA W, SEBASTIN P F, Leonardo ML,etal. Central nervous system depressant action of flavonoid glycosides[J].European Journal of Pharmacology, 2006,539(3):168-176.

Study on influence of resisting phlebothrombosis of Diosmin abstracted from Galium verum L.

SUI Wen-xia1, DONG Kun2, WAN Xiao-chen1, KOU Han-xu1, MA Ying-li1

(1.School of Pharmacy,Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150040,China;2.Heilongjiang Academy of Chinese Medical Sciences, Harbin 150036,China)

To study the influence of diosmin which is one active component abstracted fromGalium verum L. on blood rheology abnormality and the effect of resisting phlebothrombosis of rats’ models, deligation of inferior vena cavawas applied to make rats’ models of phlebothrombosis of lower extremity.A study was performed onthe influence that how diosmin ameliorated the hemorheology by assaying the indexes of blood rheology including whole blood viscosity,blood plasma viscosity, hematocrit, blood sedimentation,index of red blood cell deformation and index of erythrocyte aggregation.In the meantime,made an observation of the changes of inferior vena cave histology under a transmission electron microscope.Results indicated that compared with the model group,diosmin could improve the indexes of hemorheology obviously.It also could protect the endothelial cell functions of inferior vena cava.Diosmin can improve the abnormality of hemorheology,and further,it processes the property of resisting phlebothrombosis.

Galium verum L;diosmin;phlebothrombosis;hemorheology

2015-09-16.

国家自然科学基金项目(201281274034)；教育部博士点博导类基金资助项目(20112327110006)

隋文霞(1988-)，女，研究方向：中药活性成分的机理研究.

马英丽(1954-)，女，博士，教授，博士生导师，研究方向：中药活性成分的机理研究.

R285

A

1672-0946(2016)04-0390-05