秦巴山区多鳞白甲鱼人工繁殖试验

董武子，王 涛，马 力，刘 勇，王丽青，蒋仁铭，吉 红（.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌7200；2.安康市水产工程技术研究中心；3.安康绿水生态农业科技有限公司）

秦巴山区多鳞白甲鱼人工繁殖试验

董武子1，2，王 涛1，2，马 力2，3，刘 勇1，王丽青1，蒋仁铭2，3，吉 红1，2
（1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100；2.安康市水产工程技术研究中心；3.安康绿水生态农业科技有限公司）

多鳞白甲鱼是秦巴山区山溪河流重要的野生名贵经济鱼类。开展多鳞白甲鱼繁育技术研究，不仅有利于保护秦巴山区这一野生水生经济动物资源，而且可为其产业化开发奠定基础。2015年月到月，在陕西安康岚皋县进行了多鳞白甲鱼人工繁殖。外形观察显示多鳞白甲鱼雄鱼在繁殖期吻端和臀鳍追星明显，雌鱼缺如，可以用于雌雄亲鱼的鉴定与选择；采用二次肌肉注射法，第一次注射1200IU的HCG，5IU的FSH和4μg的LHRH－A2，间隔18h后再注射1200IU的HCG，4μg的LHRH－A2和4mg的DOM，可以成功进行多鳞白甲鱼亲鱼催产，雌雄鱼催产率分别达到80%和100%；采用干法授精（鲜精和稀释后精液），受精均能率达到83%以上；采用网箱微流水孵化和静水恒温孵化两种方式，孵化率分别为82%±3%和75%±4%，初步结果显示网箱微流水孵化效果优于静水恒温孵化效果。

多鳞白甲鱼；第二性征；人工繁殖；受精卵孵化

多鳞白甲鱼（Varicorhinus macrolepis）为鲤科鲃亚科突吻鱼属鱼类，又名多鳞铲颌鱼（Largescale shoveljaw fish）、赤鳞鱼、钱鱼，主要分布于嘉陵江水系和汉水水系的中上游，淮河上游，渭河水系，伊河、洛河和山东泰山，并呈现许多不连续的分布区域，这种不连续分布，使得多鳞白甲鱼具有丰富的地理遗传资源。多鳞白甲鱼是我国鲃亚科鱼类中现存鱼类分布最北的一种，是研究鱼类地理分布机制以及生态适应性的重要鱼类。在秦巴山区，早在1996年，许涛清调查秦岭鱼类资源显示，多鳞白甲鱼是该区域重要的常见鱼类；王开锋等（2003）调查长青自然保护区水生鱼类资源表明，多鳞白甲鱼是该区域鱼类资源多样性的重要物种；王启军等（2012）考察了湑水河鱼类资源，报道多鳞白甲鱼在该水域有分布。

随着对多鳞白甲鱼生物学的深入研究，其经济价值和生态价值越来越受到重视。多鳞白甲鱼肉质细嫩、味美不腥、营养丰富及独特的药用保健价值而闻名。但是，近年来，由于过度捕捞和人为干预导致环境改变，在主要分布区水域野生多鳞白甲鱼难觅踪迹，许多水系中的多鳞白甲鱼已濒临灭绝。因此，开展多鳞白甲鱼人工繁殖试验，研究其规模化人工繁育技术，可为保护秦巴山区这一野生水生经济动物资源及进行产业化开发提供基础。

野生多鳞白甲鱼喜栖息于砾石或沙质底，水清流急的山溪中，亲鱼将卵产于水底碎砂石中孵化，本课题组在前期工作中模仿野生生态坏境，发现秦巴多鳞白甲鱼亦能在人工模拟环境中产卵繁殖，通过沙盘收集受精卵的方式可以持续获得一定数量的受精卵，表明秦巴多鳞白甲鱼卵的发育具有不同步性，其有效繁殖率较低，而且劳动力成本较高，不适宜开展大规模繁育，因此，对其进行人工繁殖技术的研究十分必要。资料显示，与秦巴多鳞白甲鱼同种的泰山赤鳞鱼在人工繁殖技术研究和性腺发育上已有一定的进展；在秦巴山区，谢从新等（ ）收集整理了神农架多鳞铲颌鱼生物学特性，张金平等（ ）对神农架多鳞铲颌鱼繁殖生物学进行了分析，并对其精子活力进行了初步观察报道。

野生多鳞白甲鱼不连续区域分布的特点，导致不同区域的多鳞白甲鱼繁殖特性的差异；秦巴多鳞白甲鱼作为独立分布于秦巴山区的特有野生鱼类，有必要进一步开展相关人工繁殖试验。本试验针对岚河流域野生秦巴多鳞白甲鱼人工驯养一冬季的亲鱼进行了选择与鉴定、人工催产以及孵化进行了初步研究与分析。

1 材料与方法

1.1 亲鱼的来源与暂养

自秦巴山区的山溪中获得2－3冬龄、体重在120g左右的秦巴多鳞白甲鱼亲鱼，于安康市岚皋绿水生态农业有限公司流水养殖池暂养1冬龄。暂养池水流速在3m3／hrs。4月中旬开始进入繁殖的准备期，水温在18℃。饲喂人工配合饲料，每天早中晚三次，每天饲料饲喂量是鱼体重3%。5月初水温稳定在20℃左右。挑选的亲鱼分别暂养在不同池中，水的流速每分钟0.05立方。暂养1周后，用于催产。

1.2 催情激素

HCG、FSH、LHRH－A2和DOM均购买于宁波激素二厂。

1.3 亲鱼催产

亲鱼分四组进行催产处理，每组雌鱼20尾，雄鱼5尾。雌鱼每尾催产用激素剂量以及催产程序见表1。

表1 雌鱼催产用激素剂量以及催产程序

1.4 人工授精

1.4.1 精卵获取 雌雄亲鱼注射第二针后24－72小时内，每12小时检查，观察到发情现象后，及时将亲鱼从养殖池中用网捞起，放入预先置有曝气水的暂养盆中，将浸湿后的软质毛巾拧干后，从头部背面包住亲鱼，裸出后腹部和泄殖孔，并将腹部泄殖孔周围和臀鳍用干毛巾擦干，轻轻由前向后挤压腹部。将雄鱼乳白色精液挤入集精杯中，用0.9%的NaCl 按5：1稀释，充分将精液液化稀释，置于4℃冰箱中备用；若短期内使用，放到室温下即可。同时将雌鱼卵挤入小瓷碗中，室温下准备授精。

1.4.2 鱼卵的授精 受精前，用微量移液器取10μl精液于洁净的玻片上，在40倍物镜下调整好焦距，以20℃自然水激活精子，精子作云雾状运动，精子活动时间至少在30s以上，表明精子质量良好，可用于授精。

采用干法授精方法。干法授精过程：将原精液50μl或稀释后的精液100μl滴加到大约10，000枚卵的瓷碗中，用羽毛轻轻搅动，将精液与卵子充分混合后，迅速向瓷碗中加入2－3ml水，边加边摇动瓷碗，使所有的精子激活并使卵子受精，在室温下静置至少1min。最后将授精好的卵倒入孵化网箱或塑料盆中，用水冲洗瓷碗中粘附于碗壁的受精卵，并搅动水体，使受精卵脱粘，并且保证受精卵在孵化器底部成单层排列。孵化网箱或塑料盆水体的水深在30cm左右。孵化网箱置于微流水的室内水池中，孵化水温在20℃±1℃；塑料盆受精卵每天半量换水2次，孵化水温恒定在20℃。

1.5 受精卵的孵化

孵化36h左右正常受精卵发育至原肠胚期，未受精的卵或死胚呈现不同透明的乳白色，将未受精卵及时检出，计算受精率。孵化84h左右，胚胎破膜产出，计算孵化率。在受精卵孵化大约36h后的不同时间点（36h、48h、72h和84h），每个时间点分5批随机取胚胎至少300枚进行观察和相关指标的计算及分析。36h的受精率＝［（总卵数－白卵数）／总卵数］×100%；84h的孵化率＝［正常出膜仔鱼数／（出膜卵数＋48h的白卵数＋72h的白卵数＋84h的白卵数）］×100%。

2 结果与分析

2.1 雌雄亲鱼形态学鉴定

未达到性成熟的多鳞白甲鱼雌雄较难以区分，但从进入繁殖前期开始（一般4月初），雄鱼出现典型的第二性征，背鳍和臀鳍红色鲜艳婚姻色；红色越鲜艳，表明雄性性状越明显；另外，雄鱼上下颌吻端各有一横列齿状追星，臀鳍上的追星在最大的三个鳍条上呈现纵向分布，手触摸有粗糙感；在繁殖季节，轻轻挤压雄鱼腹部，从泄殖孔有少量乳白色精液流出。雌鱼虽然没有上述特征，但是性腺发育良好的雌鱼腹部明显突出于体侧；发育良好的成年雌鱼，泄殖孔前端输卵管变粗，凸显于身体表面，表明雌鱼可用于人工繁殖。

2.2 不同催产程序催产效果

2.2.1 雌鱼催产效果 根据催产后24－72h内能很好挤出卵子的个体数占总催产个体的比例计算催产率，结果见表2。

表2 不同催产程序催产效果比较结果

初步试验显示，四组催产方案对雌鱼的效应有较大差异，总体而言，催产激素未使用地欧酮则催产效率明显较差，使用4单位地欧酮的批次催产效果较好。第三组以注射2针的模式，在第二针中添加4单位的地欧酮，催产效率达到80%，比第二组未添加地欧酮催产效率30%有大幅度的提高。因此，我们最终采用第三组的催产程序，经过至少5批次的催产，均获得80%以上的催产率。

从注射部位看，尽管腹腔注射组添加了地欧酮，但是其催产效率低于肌肉注射，可能的原因是催产药物注入到内脏器官影响了药物的催产效果。因此，根据本研究的初步结果，推荐多鳞白甲鱼的催产程序采用第三组的模式，即……模式，建议采用肌肉注射。

2.2.2 雄鱼催产效果 对雄鱼无论通过哪一种催产程序，均能较好获得精液，但是腹腔注射组，有一条雄鱼挤出的精液不能液化。其原因一方面可能是催产药物被误注入内脏器官，另一方面可能与雄鱼精巢的发育状况有关。

在5月初，尽管未催产的雄鱼也能挤出精液，但是比较未催产和催产的雄鱼精液显示，经过一次催产雄鱼的精液的粘滞性相对低，液化时间短，易于在生理盐水中混合稀释，同时精子在精液中均匀分散，用水激活后精子呈现云雾状运动且存活时间均能达到45s以上；而未催产处理的雄鱼精液粘滞性高，部分个体的精液不易液化，观察精液中精子存现聚集状态，用水激活后精子存活时间短＇于30s。

2.3 人工授精效果

本试验采用干法授精方法，根据6批次的统计结果发现使用鲜精液直接授精（受精率为84%± 6%）与稀释后的精液授精（受精率83%±4%）的受精率没有明显差异。表明在雄性亲鱼数量较少的情况下，采用稀释后的精液可以用于卵的授精。今后将进行不同稀释液对多鳞白甲鱼精液品质影响的研究。

2.4 不同孵化器对受精率和孵化率的影响

本试验采用孵化网箱微流水孵化与塑料盆静水孵化两种方式进行受精卵孵化。结果见表3。

表3 微流水孵化与静水孵效果比较

根据表3结果显示，孵化网箱微流水总孵化率达到80%以上，而静水孵化的孵化率为75%左右。表明孵化网箱微流水孵化优于静水孵化。实际生产中，静水孵化可以预先对水体曝气、易于控制水温，仔鱼基本上在同一时间内出膜，但是孵化过程中由于换水间隔时间长，卵容易聚集，导致坏卵影响正常受精卵的孵化，而且大规模孵化时，显著增加劳动量；而微流水孵化的优点是网箱安置在较大水体内，流动的水体溶氧保持在恒定的水平。但另一方面，难以控制水温是主要的问题。

3 讨论

野生秦巴多鳞白甲鱼分布范围很广，因栖息环境的差异，其生理特性亦存在一定差异。尽管本试验所用的亲鱼是野生多鳞白甲鱼经1冬季的人工驯养的群体，通过亲鱼的外部表现进行了选择，但是栖息地差异或不同年龄个体的性腺发育程度可能有差别，因此，在进行人工繁殖前，有必要开展亲鱼的强化培育，促使其性腺发育的同步化。资料显示，一些鱼类在开展人工繁殖前期，进行强化培育取得了较好的结果。香鱼产卵前3个月，用不同维生素E含量（1－39mg／kg）的饲料进行饲喂，结果39mg／kg维生素E饲喂组的亲鱼全部产卵，低维生素E组有1／3亲鱼不产卵，且卵的孵化率和仔鱼的成活率均显著提升。观察发现秦巴多鳞白甲鱼卵分批成熟多次产卵特性，通过早期培育促进卵的同步发育成熟以及鉴定亲鱼的性腺成熟度可能是开展高效人工繁殖的关键。有关营养供给对秦巴多鳞白甲鱼性腺发育的影响有待进一步研究。

秦巴多鳞白甲鱼卵分批成熟多次产卵特性表明，在人工催产过程中，首先要促进卵的发育，使未成熟卵在一定时期内启动发育并达到成熟，FSH和HCG的主要作用是促进卵的成熟，因此，本试验中第一针使用FSH和HCG为主要催产激素进行注射，主要目的是促进卵的成熟，一段时间效应期后，注射第二针进行催产，这样的催产程序在其他小型鱼类如黄颡鱼催产上有较好的效果。本试验中第三组实验结果显示，催产用激素种类、使用剂量和催产程序达到了较好的效果，催产率达到80%。但是秦巴多鳞白甲鱼作为一种偏冷水性的鱼，有必要其对催产激素最佳剂量配比、注射后的效应时间等进行研究。

本研究发现，秦巴多鳞白甲鱼亲鱼进入5月后，雄鱼基本上性腺发育成熟，可以参与繁殖；通过人工催产可以促进精子的进一步成熟并排精，并有利于提高卵的受精率。本试验秦巴多鳞白甲鱼卵受精率平均低于65%，受精率处于一个较低的水平。分析其可能的原因包括：根据繁殖生物学特性分析，野生多鳞白甲鱼卵发育具有不同步性，催产后排出的卵发育程度不一致；亲鱼繁殖前雌雄混合培育模式影响卵巢的发育差异；同时，不能排除精液质量的问题。因此，开展亲鱼培育采用雌雄分饲以及促进雌雄鱼性腺同步发育的饲料添加剂的研究是后续研究的重要课题。

秦巴多鳞白甲鱼受精卵孵化最好采用模拟野生状态的仿生态孵化模式。本试验比较了两种孵化方式的效果，结果表明孵化网箱微流水孵化模式孵化效率明显优于静水孵化模式，可能的原因是孵化网箱微流水孵化模式水温在一定范围变化，更接近于野生状态，推断适当的水温适宜变化可能有利于胚胎的正常发育。

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Artificial Reproduction of Varicorhinus Macrolepis in Qin－Ba Mountains

Dong Wu－zi1，Wang Tao1，Ma Li2，Liu Yong1，Wang Li－qing1，Jiang Ren－ming2，Ji Hong1
（1.College of Animal Science and Technology，Northwest A＆F University，Yangling Shaanxi 712100 China；2.Ankang municipality aquatic engineering technology research center，Ankang Shaanxi 725400；3.Ankang Lvshui Ecological Agriculture Science and Technology co.，LTD，Ankang Shaanxi 725400）

Varicorhinus macrolepis is an important economic fish in Qin－Ba Mountains.Technique of artificial reproduction of Varicorhinus macrolepis is a key to not only promote industrialization development but also to protect the resources of them.In this experiment，we observed the second sexuality characters of gender differences which could be used to select and identify male and female for artificial reproduction in the breeding season.A success model of twice muscle injection of certain proportion of hormones，which second injection was performed using 1200IU HCG，4μg LHRH－A2and 4mg DOM at 18hafter the fish were injected using 1 200IU HCG，5IU FSH and4μg LHRH－A2，used for ovulation and spermiation.The results displayed that the rate of ovulation individuals was above 80%and rate of spermiation individuals was 100%，and dry fertilization rate was over 83%.Furthmore，the hatching rate of the fertile eggs in micro－flow and in static water was 82%and 75%，respectively.It suggested that hatching way of the fertile eggs in micro－flow would be recommended in artificial reproduction of Varicorhinus macrolepis.

Varicorhinus macrolepis；the second sexuality characters；artificial reproduction；zygotes hatching

S 961.2

A

1004－6704（2016）03－0027－04

2015－09－107

陕西省水利厅科技计划项目（2015slkj－09）；陕西省科技厅农业攻关项目（2014K01－20－01）；杨凌示范区农业科技示范推广能力提升项目（2014YLTG－20－04）；安康市科技计划项目（2014AK02－12）。

董武子（1969－），男，湖北洪湖人，博士，副教授，主要从事水生野生动物保护与繁殖生物学研究，E－mail：dongwuzi＠nwsuaf.edu.cn.

＊ 吉红（1968－），男，河南灵宝人，博士，教授，主要从事水产养殖及鱼类营养代谢调控研究。E－mail：jihong＠nwsuaf.edu.cn