长链非编码RNA GAS5对人乳腺癌细胞株增殖和侵袭能力的影响

吴海华，李　钰,张凌宇,王海凤，陈　丽,黄文明,陈素莲,陈昌杰,杨清玲



·基础医学·

长链非编码RNA GAS5对人乳腺癌细胞株增殖和侵袭能力的影响

吴海华1，李钰1,张凌宇1,王海凤1，陈丽2,黄文明2,陈素莲3,陈昌杰3,杨清玲3

目的：探讨长链非编码RNA GAS5对人乳腺癌细胞增殖、侵袭及迁移生物学活性的影响。方法：qRT-PCR方法检测3株乳腺癌细胞株SKBR-3、 MDA-MB-231及MCF-7中LncRNA GAS5的表达；LncRNA GAS5干扰片段和过表达载体分别转染LncRNA GAS5高表达以及低表达的乳腺癌细胞株，qRT-PCR方法检测转染后LncRNA GAS5的表达；磺酰罗丹明B染色法检测细胞的增殖能力；Transwell和划痕实验检测细胞的侵袭及迁移能力。结果：LncRNA GAS5在乳腺癌SKBR-3细胞中表达量最低，MCF-7细胞中表达量最高(P<0.01)；SKBR-3以及MCF-7细胞分别转染LncRNA GAS5过表达载体和干扰片段后，SKBR-3细胞LncRNA GAS5表达量增高，MCF-7表达量降低(P<0.01)；下调LncRNA GAS5的表达，细胞的增殖能力升高，侵袭及迁移能力增强(P<0.01)；过表达LncRNA GAS5之后，细胞的增殖能力、侵袭和迁移能力减弱(P<0.01)。结论：LncRNA GAS5是涉及到乳腺癌发展的一个新型的分子，有可能成为乳腺癌治疗的潜在靶点。

乳腺肿瘤；长链非编码RNA；GAS5；增殖；迁移；侵袭

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，据统计，2014年美国有232 670例新确诊的乳腺癌病例，有40 000例患者死于乳腺癌[1]。尽管目前对乳腺癌的治疗已经取得了很大的进步，但仍有高达30%的患者在接受正规的治疗后死于乳腺癌的复发和转移[2]，因此对其转移的机制进行研究就显得尤为重要。长链非编码RNAs(the Long Non-Coding RNAs,LncRNAs)是一类转录本长度超过200 nt且不编码蛋白的RNA分子。最近研究[3-4]发现LncRNAs在癌症的形成过程中发挥关键的作用，参与调控细胞的增殖、凋亡、侵袭及转移等过程。LncRNA GAS5最初是通过消减杂交的方法从NIH 3T3细胞中分离出来，目前越来越多的研究[5-7]发现LncRNA GAS5在许多癌症中发挥着不同的调控作用，如LncRNA GAS5在前列腺癌、肾细胞癌以及乳腺癌细胞中低表达充当着抑癌基因的角色，而在骨肉瘤细胞中高表达发挥着癌基因的作用[8]。已有报道[9]称LncRNA GAS5在调控细胞的周期及凋亡方面发挥关键的作用，但对其在调控细胞的侵袭及转移方面的研究较少。本研究就LncRNA GAS5对乳腺癌细胞增殖、侵袭及转移能力的影响作一探讨。

1　材料与方法

1.1材料与试剂 人乳腺癌细胞株MCF-7、SKBR-3和MDA-MB-231购自中国科学院细胞库；胎牛血清购自Hlyclone公司；DMEM高糖培养基和G418购自Gibco公司； Trizol试剂和Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；逆转录试剂盒购自Fermentas公司；LncRNA GAS5干扰片段及过表达载体购自上海吉玛制药技术有限公司；质粒提取试剂盒购自AXYGEN公司；所有引物合成和DNA序列测定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2方法

1.2.1细胞培养人乳腺癌SKBR-3、MDA-MB-231以及MCF-7细胞株均购买于中国科学院细胞库，接种于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，放置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱中培养。细胞每2～3 d传代1次，所有实验均采用对数生长期细胞。

1.2.2qRT-PCR检测LncRNA GAS5的表达情况Trizol法提取总RNA，根据逆转录试剂说明书进行逆转录反应，按照荧光定量试剂盒说明书进行实时PCR反应。GAPDH作为内参，所用的引物序列见表1。

表1　引物序列

1.2.3转染LncRNA GAS5干扰片段和过表达载体取对数生长期细胞，0.25%胰酶消化，离心，将细胞制成单细胞悬液种于6孔板中，使第2天细胞密度达到70%～90%。将5 μL浓度为20 μmol/L的LncRNA GAS5干扰片段(或4 μg含LncRNA GAS5全基因的质粒)稀释于250 μL无血清培养基中，5 μL Lipofectamine 2000(转染质粒需10 μL Lipofectamine 2000)稀释于250 μL无血清培养基中，室温静置5 min。将稀释好的干扰片段或质粒与Lipofectamine 2000混匀，室温静置20 min。在6孔板中每孔加入无血清培养基1.5 mL，将转染混合物缓慢加入6孔板中，6 h以后换成含10%胎牛血清的完全培养基。LncRNA GAS5干扰片段序列为：5′-UCC UAA AGA GCA AGC CUA AT-3′;5′-UUA GGC UUG CUC UUU AGC ATT-3′。

1.2.4磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)染色法检测细胞的增殖活性取对数生长期细胞，0.25%胰酶消化，离心，将细胞制成单细胞悬液种于96孔板中培养过夜，使细胞贴壁生长；对细胞进行加药处理后24 h、48 h、72 h分别终止培养，吸出培养液并且每孔加入200 μL 10%三氯乙酸(TCA)，4 ℃，固定50 min；用双蒸水洗涤5遍，室温下晾干；每孔加入100 μL 0.4% SRB染液，染色30 min；弃染液，用1%乙酸溶液轻轻洗涤5遍，室温下晾干；每孔加入150 μL 10 mmol/L Trisbase溶液，摇床上剧烈振荡15 min，使SRB充分溶解,最后用酶标仪检测波长515 nm处的吸光度值。抑制率={(实验组吸光度值-阴性对照组吸光度值)/阴性对照吸光度值}×100%。

1.2.5划痕实验检测细胞的迁移能力胰酶消化对数生长期细胞，离心将细胞制成单细胞悬液种于6孔板中，5% CO2、37 ℃培养过夜。当细胞生长达到80%～90%时，用10 μL无菌枪头相同力度在细胞板中间轻轻划出一道伤口，注意保持各组划出伤口宽度基本一致，用PBS洗涤2次，对细胞进行相应的加药处理。分别于加药培养后0、48 h在低倍镜下测量各组细胞任意3个部位的不同伤口的宽度。

1.2.6Transwell实验检测细胞的侵袭能力胰酶消化对数生长期细胞，用无血清培养基将每组的细胞调整到相同细胞密度。按照实验分组，每组各取100 μL加入Transwell小室的上室。Transwell小室的下室加入600 μL 含10%胎牛血清的DMEM培养基，5%CO2、37 ℃培养箱中培养24 h。取出Transwell小室，用棉签小心擦去Transwell小室上室的培养基以及膜上部未穿过的细胞，4%多聚甲醇固定20 min，吉姆萨染液染色，拍照观察高倍镜下穿过的细胞数目。

1.3统计学方法采用方差分析和q检验及t检验。

2　结果

2.1人乳腺癌细胞株SKBR-3、MDA-MB-231和MCF-7中LncRNA GAS5表达水平比较qRT-PCR结果显示：3株乳腺癌细胞SKBR-3、MDA-MB-231和MCF-7均可表达LncRNA GAS5，但LncRNA GAS5在MCF-7细胞中表达量最高，在SKBR-3细胞中表达量最低，各株细胞间差异均有统计学意义(P<0.01)(见表2)。因此在后续的实验中选用MCF-7细胞做LncRNA GAS5的干扰实验，用SKBR-3细胞构建LncRNA GAS5高表达细胞株。

q检验：与SKBR-3组比较*P<0.05,**P<0.01;与MDA-MB-231组比较△△P<0.01

2.2si-GAS5明显降低LncRNA GAS5在MCF-7细胞中的表达为了进一步研究LncRNA GAS5在人类乳腺癌中的作用，LncRNA GAS5特异性的siRNA(si-GAS5)被转入到MCf-7细胞中，非特异性的siRNA作为阴性对照(si-NC)。与si-NC组比较，si-GAS5组LncRNA GAS5的表达量明显降低(P<0.01)(见表3)。

表3　si-GAS5对MCF-7细胞LncRNA GAS5表达的影响

2.3pcDNA-GAS5对SKBR-3细胞LncRNA GAS5表达的影响为了评估LncRNA GAS5在人乳腺癌细胞中的作用，pcDNA-GAS5载体被转入到SKBR-3细胞中，以空载体组作为对照。与空载体组比较，pcDNA-GAS5载体组LncRNA GAS5的表达量升高，并以pcDNA-GAS5-2升高较明显(P<0.01)(见表4)。

q检验：与pcDNA-NC组比较**P<0.01;与pcDNA-GAS5-1组比较△△P<0.01

2.4LncRNA GAS5对乳腺癌细胞增殖的影响为探讨LncRNA GAS5在乳腺癌细胞中的生物学作用，采用SRB实验对LncRNA GAS5对乳腺癌细胞增殖的作用进行了研究。结果显示，与si-NC转染组比较，si-GAS5转染组明显促进乳腺癌MCF-7细胞的增殖(P<0.01)(见表5)，24、 48、72 h的增殖诱导率分别为40.3%、13.2%以及8.8%；与pcDNA-NC组比较，pcDNA-GAS5组明显抑制细胞的增殖(P<0.01)(见表6)，24、48、72 h的增殖抑制率分别为9.1%、15.2%、12.3%。

表5　si-GAS5对MCF-7细胞的增殖促进作用

表6　pcDNA-GAS5对SKBR-3细胞的增殖抑制作用

2.5LncRNA GAS5对乳腺癌细胞侵袭及迁移的影响采用划痕实验和Transwell实验研究了LncRNA GAS5对乳腺癌细胞侵袭及迁移能力的调控作用。与si-NC转染组相比，划痕实验结果表明，si-GAS5转染组的迁移率明显上调(见图1A)，Transwell实验结果表明，si-GAS5转染组侵袭的细胞数明显增多(P<0.01)(见表7，图1B)。而在乳腺癌SKBR-3细胞中上调LncRNA GAS5的表达发现，相对于pcDNA-NC转染组，pcDNA-GAS5转染组细胞的侵袭及迁移能力明显降低(P<0.01)(见图1C、1D、表8)。

表7　si-GAS5 对MCF-7细胞迁移能力的影响

表8　pcDNA-GAS5对SKBR-3细胞迁移能力的影响

3　讨论

随着人们对LncRNA的不断认识，越来越多的研究[10]表明肿瘤形成的分子机制不仅与蛋白编码基因有关,而且与许多的LncRNA有关。虽然目前一些LncRNAs已经被证明在肿瘤的形成及发展过程中发挥着关键的作用，但是仅有一小部分的LncRNAs被研究，仍有许多重要的问题需要解决。本课题主要研究LncRNA GAS5 在肿瘤发生发展中的作用。

LncRNA GAS5是一个长度为650 bp的LncRNA，由1q25基因编码，这个基因座位与淋巴瘤高度相关[11]。LncRNA GAS5在许多肿瘤中充当着抑癌基因的角色，调控肿瘤的发生与发展。QIN等[12]研究发现LncRNA GAS5在肾细胞癌中的低表达与肾细胞癌的发生与发展有关，并且LncRNA GAS5的高表达对肾细胞癌起到抑制的作用；TU等[13]研究发现LncRNA GAS5在多数肝癌病人组织中低表达，并且LncRNA GAS5的表达是肝癌的独立预后指标。还有研究[8]发现LncRNA GAS5在骨肉瘤中表达上调，通过间接调控miR-21参与骨肉瘤细胞的凋亡和自噬过程。虽然目前关于LncRNA GAS5的研究已有很多，但有关LncRNA GAS5在乳腺癌中作用的研究较少。

LncRNA GAS5可以通过多种不同的方式对肿瘤的发生与发展进行调控。有报道[14]称LncRNA GAS5可以与真核细胞转录因子eIF4E以及c-myc mRNA共同作用调控c-myc的翻译，进而促进胚胎的发育以及肿瘤的形成；LIU等[15]研究发现LncRNA GAS5可以与转录激活因子YBX1相互作用，下调LncRNA GAS5的表达降低YBX1蛋白水平，继而降低p21的表达，减少对细胞周期的阻断作用，促进细胞的增殖；还有大量的研究[16-18]报道称LncRNA GAS5通过负向调控CDK6的表达进而抑制前列腺癌、膀胱癌以及胃癌等恶性肿瘤细胞的增殖。另外还有文献[10，19]报道了LncRNA GAS5与肿瘤的增殖、侵袭及转移之间的关系，但在乳腺癌中LncRNA GAS5与细胞侵袭及转移的关系仍未见报道。

为了进一步阐明LncRNA GAS5在乳腺癌发展中的作用机制，本研究比较了3株乳腺癌细胞株中LncRNA GAS5的表达量。结果发现LncRNA GAS5在MCF-7细胞中表达量最高，在SKBR-3细胞中表达量最低，因此在后续的实验中用MCF-7细胞做LncRNA GAS5干扰试验，用SKBR-3细胞过表达LncRNA GAS5来进行研究。在MCf-7细胞中下调LncRNA GAS5的表达，可以明显地促进乳腺癌细胞的增殖，增加乳腺癌细胞的侵袭及迁移能力。相反，在SKBR-3细胞中上调LncRNA GAS5的表达，可以抑制乳腺癌细胞的增殖，降低乳腺癌细胞的侵袭及迁移能力，表明LncRNA GAS5可以影响乳腺癌细胞发生及发展过程。这些结果表明LncRNA GAS5在乳腺癌细胞中可能是作为一个肿瘤抑制基因，它的缺乏或者表达降低都可能导致乳腺癌的发生。

综上，下调LncRNA GAS5的表达在乳腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移中发挥了关键的作用。LncRNA GAS5是涉及到乳腺癌发展的一个新型的分子，有可能成为乳腺癌治疗的潜在靶点。

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(本文编辑姚仁斌)

The effect of LncRNA GAS5 on prolification,migration and invation in breast cancer cells

WU Hai-hua1,LI Yu1,ZHANG Ling-yu1,WANG Hai-feng1,CHEN Li2,HUANG Wen-ming2,CHEN Su-lian3,CHEN Chang-jie3,YANG Qing-ling3

(1.ClinicalTestingandDiagnoseExperimentalCenter，2.DepartmenofBioscience，3.DepartmentofBiochemistry&MolecularBiology,BengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233030,China)

Objective:To investigate the effect of LncRNA GAS5 on prolification,migration and invation in breast cancer cells.Methods:To achieve our goal,we used qRT-PCR assay to detect the expression of LncRNA GAS5 in breast cancer SKBR-3,MDA-MB-231 and MCF-7 cells;SRB assay was used to measure the prolification ability of breast cancer cells;Wound healing and Transwell assay was used to dentect the ability of invation and migration in breast cancer cells.Results:Among the three breast cancer cell lines,the expression level of LncRNA GAS5 in SKBR-3 cell is lowest and the expression level of LncRNA GAS5 in MCF-7 cell is highest(P<0.01).After transfected MCF-7 or SKBR-3 cells with si-GAS5 or pcDNA-GAS5-vertor,the expression level of LncRNA GAS5 in MCF-7 cells is down-regulated and in SKBR-3 cells is up-regulated(P<0.01),depletion of LncRNA GAS5,the prolification,invation and migration ability of MCF-7 cells is increased(P<0.01).Overexpression of LncRNA GAS5 made the prolification,invation and migration ability of SKBR-3 cells decreased(P<0.01).Conclusions:lncRNA GAS5 is a novel molecule involved in breast cancer progression,which provide a potential therapeutic target.

breast neoplasms;the long non-coding RNA;GAS5;prolification;invation;migration

2016-05-05

安徽省教育厅自然科学重大项目(KJ2015ZD29，KJ2016SD37)；安徽省自然科学基金项目(1508085MH159)；安徽省高校学科(专业)拔尖人才学术资助重点项目(gxbjZD2016069)；国家级大学生创新项目(201410367023)；蚌埠医学院大学生创新项目(201510367022);蚌埠医学院研究生创新项目(Byycx1524)

单位] 蚌埠医学院1.临床检验诊断学实验中心,2.生物科学系,3.生物化学教研室,安徽 蚌埠 233030

[作者简介] 吴海华(1989-)，女，硕士研究生.

杨清玲，硕士，硕士研究生导师，教授.E-mail：yqlmimi@163.com

1000-2200(2016)07-0849-05

R 737.9

A

10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.07.003