钙蛋白酶抑制剂Calpeptin对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移的影响

张梦晓，孙小锦，张智瑞，潘　琼，赵素容，刘　浩



·基础医学·

钙蛋白酶抑制剂Calpeptin对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移的影响

张梦晓，孙小锦，张智瑞，潘琼，赵素容，刘浩

目的：探讨钙蛋白酶抑制剂Calpeptin对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移能力的影响，为治疗乳腺癌转移提供思路。方法：MTT法检测不同浓度Calpeptin对MDA-MB-231细胞增殖的影响；细胞划痕实验及Transwell迁移实验检测不同浓度的Calpeptin对MDA-MB-231细胞迁移的影响；Western blot法检测不同浓度Calpeptin对MDA-MB-231细胞基质金属蛋白酶-2表达的影响。结果：Calpeptin可抑制MDA-MB-231细胞的增殖，其增殖抑制作用随浓度的增大而增加(P<0.01)。Calpeptin作用MDA-MB-231细胞24 h后，细胞的迁移能力明显下降(P<0.01)。Western blot结果显示，Calpeptin可下调MDA-MB-231细胞中细胞基质金属蛋白酶-2的表达。结论：Calpeptin能够抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移，其机制可能与下调MMP-2的表达有关。

乳腺肿瘤；MDA-MB-231细胞；钙蛋白酶；Calpeptin；迁移；细胞基质金属蛋白酶-2

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，全身系统性转移是乳腺癌发展的最终结果，也是导致患者死亡的主要原因，其具体机制仍不完全清楚。钙蛋白酶(calpain)是依赖于Ca2+的蛋白水解酶，其在肿瘤发生发展中的作用是近年来的研究热点[1-2]，calpain抑制剂也是抗肿瘤药物开发的重要方向[3]。本研究以乳腺癌MDA-MB-231细胞为对象，观察了calpain抑制剂Calpeptin对MDA-MB-231细胞增殖及迁移能力的影响，并对其作用机制进行初步探讨，以期为乳腺癌转移的治疗提供思路。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，购自美国ATCC，蚌埠医学院生化药理学实验室冻存。

1.1.2主要试剂及耗材DMEM培养基购自Gibco公司；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青工程材料有限公司；Calpeptin购自Sigma公司；兔抗人MMP-2抗体购自Abcam公司；鼠抗人β-actin抗体、山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG购自Biosharp公司；Transwell小室、细胞培养瓶及培养板购自Corning公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养MDA-MB-231细胞培养于含10%FBS的DMEM培养基中，置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2的条件下培养。

1.2.2MTT法检测细胞存活率取处于对数生长期的细胞，以5×104/mL的密度接种于96孔板中，每孔100 μL，24 h后换用无血清DMEM培养。实验设置调零组、对照组和不同浓度Calpeptin(10、20、50、100 μmol/L)处理组。培养24 h或48 h后，每孔加入MTT溶液 15 μL，放入培养箱中继续培养4 h后，弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，490 nm波长处测定吸光度值。以(OD给药组-OD调零组)/(OD对照组-OD调零组)×100%计算细胞存活率。

1.2.3细胞划痕实验取对数生长期的细胞，以1×105/mL的密度接种于6孔板，每孔2 mL，培养24 h。待细胞生长至90%融合时，用200 μL的无菌枪头沿孔中心刻痕，弃去原有培养基，用PBS漂洗3次。每孔加入含1% FBS的DMEM培基2 mL。实验分为对照组和不同浓度的Calpeptin(10、20、50 μmol/L)处理组。分别于处理的0 h和24 h观察划痕愈合情况并拍照。采用Image J软件分析划痕愈合率。

1.2.4Transwell迁移实验取对数生长期的细胞，消化后用无血清DMEM培养基重悬，Transwell小室的上室中加入200 μL含或不含药物的细胞悬液，每孔5×104个细胞；下室加入600 μL含5%FBS的DMEM培养基。实验分组同细胞划痕实验。于培养箱内培养24 h后，取出小室，PBS漂洗3次，室温下置于4%多聚甲醛固定15 min，湿棉棒擦除上室细胞后，1%结晶紫染液室温下染色15 min，显微镜下每孔随机取5个视野拍照，细胞计数。

1.2.5Western blot法检测蛋白表达取对数生长期的细胞，接种于6 cm培养皿中，培养至90%融合。实验分组同细胞划痕实验。处理24 h后，消化收集细胞，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液冰上裂解30 min，离心后吸取上清液，BCA法测定蛋白浓度。每组取20 μg蛋白，经SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜，5 %脱脂牛奶室温封闭4 h后，一抗4 ℃孵育过夜，TPBS洗膜后，二抗室温孵育2 h，ECL发光显影，Bio-Rad凝胶成像系统获取图像。

1.3统计学方法采用方差分析和q检验。

2　结果

2.1不同浓度Calpeptin对MDA-MB-231细胞增殖的影响MTT结果显示，与对照组比较， 10、20、50、100 μmol/L的Calpeptin作用于MDA-MB-231细胞24 h和48 h存活率均明显降低(P<0.01)，且Calpeptin对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用均随浓度和作用时间的增加而增强(见表1)。

q检验：与对照组比较**P<0.01；与10 μmol/L Calpeptin组比较△△P<0.01；与20 μmol/L Calpeptin组比较##P<0.01；与50 μmol/L Calpeptin组比较&&P<0.01

2.2不同浓度Calpeptin对MDA-MB-231细胞迁移的影响划痕实验结果显示，经不同浓度Calpeptin处理后，MDA-MB-231细胞的划痕愈合率明显低于对照组(P<0.01)，且随着Calpeptin浓度增加，MDA-MB-231细胞划痕愈合率显著降低(P<0.01)(见图1、表2)。

q检验：与对照组比较**P<0.01；与10 μmol/L Calpeptin组比较△△P<0.01；与20 μmol/L Calpeptin组比较##P<0.01

Transwell迁移实验结果显示，使用不同浓度Calpeptin处理MDA-MB-231细胞后，穿膜进入Transwell下室的细胞数目均较对照组明显减少(P<0.01)，且下室细胞数目随Calpeptin浓度的增加而减少(P<0.01)(见图2、表3)。

2.3Calpeptin下调MDA-MB-231细胞中MMP-2的表达Western blot法结果显示，采用Calpeptin处理24 h后，MDA-MB-231细胞中MMP-2的表达下降(见图3)。

q检验：与对照组比较**P<0.01；与10 μmol/L Calpeptin组比较△△P<0.01；与20 μmol/L Calpeptin组比较##P<0.01

3　讨论

Calpain是一类钙依赖性的半胱氨酸蛋白酶，已知有16种亚型，其中calpain-1和calpain-2是最主要的同工酶。calpain通过有限的蛋白水解作用调控多种蛋白质的生物学活性，在细胞骨架重构、神经发育、细胞周期调控与凋亡、葡萄糖转运、细胞信号转导等生理过程中有重要作用。恶性肿瘤细胞中calpain的表达或活性常明显升高，如calpain在胆囊癌组织内呈高表达，且表达阳性率明显高于癌旁组织，提示其可能与癌症的疾病进展正相关[4]；而乳腺肿瘤中，calpain的活性明显增高，可剪切乳腺癌细胞表面的人表皮生长因子受体2，降低肿瘤细胞对内分泌治疗的敏感性[5]。以往的研究结果显示，抑制calpain的活性可导致多种肿瘤细胞的死亡[1]，因此calpain抑制剂的开发是抗肿瘤药物研发的重要方向。calpeptin是一种人工合成的高效、具有细胞渗透性的、广泛的calpain抑制剂，其在动物实验中显示出较好的对脑缺血再灌注损伤的保护作用，提示其有可能被开发成药物应用于临床。MATAGA等[6]的研究结果表明，calpeptin可将MDA-MB-231细胞阻滞在S期并增加其早期凋亡。本研究结果证实，calpeptin可浓度依赖地抑制MDA-MB-231细胞的增殖(P<0.01)。

肿瘤转移是一个多因素调控、多阶段、连续复杂的生物学过程，细胞迁移能力的大小被认为是肿瘤转移的限速环节。肿瘤细胞在细胞外基质(extracellular matrix,ECM)中的运动可分为4个步骤：(1)细胞前缘伪足形成与延伸；(2)细胞前段局部黏着斑形成；(3)肌动-肌球蛋白复合体介导细胞体收缩；(4)细胞尾部黏着斑解离。calpain的活化是导致细胞迁移能力增强的重要原因。已证实，参与黏着斑形成的多种蛋白，如黏着斑激酶、整合素、ezrin、talin等均是calpain的底物[2]，calpain通过蛋白水解作用，切断整合素与肌动蛋白细胞骨架的联结，使细胞尾部黏着斑解体，促进细胞的迁移。此外，CORTESIO等[8]发现，在乳腺癌细胞中，calpain-2的活化对于伪足的形成是必需的，使用RNA干扰降低calpain-2的表达后，伪足的形成及细胞的侵袭能力被明显抑制。因此，抑制calpain的活性可能成为抑制肿瘤细胞迁移的重要手段。本研究采用细胞划痕实验及Transwell迁移实验证明，calpeptin能够抑制MDA-MB-231细胞的迁移，且其抑制作用随药物浓度的增大而增加(P<0.01)。

在肿瘤转移的过程中，ECM的降解和基膜的破坏是一个关键步骤。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是一类锌离子依赖的蛋白水解酶，能降解几乎所有ECM成分。一般认为MMP-2与肿瘤转移的关系十分密切。多个研究表明calpain可增加MMP-2的表达。calpain的小亚基(Capn4)可通过磷酸化FAK及Src激活FAK-Src信号通路，进而上调肝癌细胞中MMP-2的表达[8]，使用siRNA下调calpain的表达后，肝癌细胞的MMP-2和MMP-9的分泌显著降低；而在鼻咽癌细胞中，Capn4通过活化核因子-κB增加MMP-2的表达，增加肿瘤细胞的侵袭迁移能力[9]。本研究结果表明，Calpeptin能降低MDA-MB-231细胞中MMP-2的表达。

总之，本研究发现，钙蛋白酶抑制剂Calepetin对MDA-MB-231细胞迁移具有明显的抑制作用，其机制可能与其下调靶细胞内MMP-2的表达有关。本研究为calpeptin抗肿瘤作用的开发提供了理论基础，也为以calpain为抗肿瘤治疗靶点提供了思路。

[1]STORR SS,CARRAGHER NN,FRAME MM,etal.The calpain system and cancer[J].Nat Rev Cancer,2011,11(5):364.

[2]MORETTI DD,DEL BELLO BB,ALLAVENA GG,etal.Calpains and cancer:friends or enemies?[J].Arch Biochem Biophy,2014,564:26.

[3]LELOUP LL,WELLS AA.Calpains as potential anti-cancer targets[J].Expert Opin Ther Targets,2011,15(3):309.

[4]LUO WW,REN ZZ,GAO SS,etal.Clinical correlation of calpain-1 and glypican-3 expression with gallbladder carcinoma[J].Oncol Letters,2016,11(2):1345.

[5]PU XX,STORR SS,AHMAD NN,etal.Calpain-1 is associated with adverse relapse free survival in breast cancer:a confirmatory study[J].Histopathology,2016,68(7):1021.

[6]MATAGA MM,ROSENTHAL SS,HEERBOTH SS,etal.Anti-breast cancer effects of histone deacetylase inhibitors and calpain inhibitor[J].Anticancer Res,2012,32(7):2523.

[7]CORTESIO CC,CHAN KK,PERRIN BB,etal.Calpain 2 and PTP1B function in a novel pathway with Src to regulate invadopodia dynamics and breast cancer cell invasion[J].Cell Biol,2008,180(5):957.

[8]DAI ZZ,ZHOU SS,ZHOU ZZ,etal.Capn4 contributes to tumour growth and metastasis of hepatocellular carcinoma by activation of the FAK-Src signalling pathways[J].Pathol,2014,234(3):316.

[9]ZHENG PP,CHEN XX,ZHU HH,etal.Capn4 is a marker of poor clinical outcomes and promotes nasopharyngeal carcinoma metastasis via nuclear factor-κB-induced matrix metalloproteinase 2 expression[J].Cancer Sci,2014,105(6):630.

(本文编辑刘璐)

Effect of calpain inhibitor Calpeptin on the migration of MDA-MB-231 breast cancer cells

ZHANG Meng-xiao,SUN Xiao-jin,ZHANG Zhi-rui,PAN Qiong,ZHAO Su-rong,LIU Hao

(DepartmentofPharmacy,BengbuMedicalCollege,AnhuiEngineeringTechnologyResearchCenterofBiochemicalPharmaceuticals,BengbuAnhui233030,China)

Objective:To investigate the effects of calpain inhibitor Calpeptin on the migration of MDA-MB-231 breast cancer cells for providing an idea in treating the metastatic breast cancer.Methods:The effects of different concentrations of Calpeptin on the proliferation of MDA-MB-231 cells were determined using MTT assay.The effects of different concentrations of Calpeptin on the migration of MDA-MB-231 cells were detected using the wound healing assay and transwell migration assay.The effects of different concentrations of Calpeptin on the expression of matrix metalloproteinase-2(MMP-2) in MDA-MB-231 cells were detected using Western blot.Results:Calpeptin could suppress the proliferation of MDA-MB-231 breast cancer cells,the inhibiting effects of which increased with the increasing of the concentrations of Calpeptin(P<0.01).The migration ability of MDA-MB-231 cells decreased significantly after 24 h of treatment with Calpeptin(P<0.01).The result of Western blot showed that Calpeptin could down-regulate the expression of MMP-2 in MDA-MB-231 cells.Conclusions:Calpeptin can inhibit the migration of MDA-MB-231 cells,the mechanism of which may involve in the down-regulation of MMP-2.

breast neoplasms;MDA-MB-231;cells calpain;Calpeptin;migration;matrix metalloproteinase-2

2016-05-21

国家自然科学基金项目(81372899)；蚌埠医学院自然科学基金项目(Byky1447)

单位] 蚌埠医学院 药学系，安徽省生化药物工程技术研究中心，安徽 蚌埠 233030

[作者简介] 张梦晓(1988-)，女，硕士，助教.

刘浩，博士，硕士研究生导师，教授.E-mail:liuhao6886@foxmail.com

1000-2200(2016)07-0841-04

R 737.9

A

10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.07.001