排石冲剂对高龄肾结石大鼠TGF-β1、KIM-1表达的影响*

罗俊华　魏金霞（广州军区武汉总医院，湖北 武汉430070）



排石冲剂对高龄肾结石大鼠TGF-β1、KIM-1表达的影响*

罗俊华魏金霞
（广州军区武汉总医院，湖北 武汉430070）

目的 观察排石冲剂对高龄肾结石大鼠转化生长因子β1（TGF-β1）、肾损伤分子（KIM-1）表达的影响。方法 将40只雄性高龄Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、枸橼酸钾组和排石冲剂组，每组10只。采用1%乙二醇自由饮水和2%氯化铵灌胃建立大鼠草酸钙肾结石模型，同时各组给予相应药物，观察大鼠一般情况、体质量、24 h尿量，显微镜下观察肾组织切片中草酸钙结晶沉积，并采用酶联免疫吸附法及免疫组化法检测外周血及肾组织中TGF-β1、KIM-1的水平。结果 4周末大鼠24 h尿量比较，枸橼酸钾组和排石冲剂组均高于正常组和模型组（P＜0.05）；枸橼酸钾组与排石冲剂组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。枸橼酸钾组和排石冲剂组草酸钙结晶评分均高于正常组，低于模型组（P＜0.05）；排石冲剂组结晶评分低于枸橼酸钾组（P＜0.05）。枸橼酸钾组、排石冲剂组血清及肾组织TGF-β1、KIM-1水平明显低于模型组（P＜0.05）。与枸橼酸钾组比较，排石冲剂组血清及肾组织TGF-β1、KIM-1水平显著下降（P＜0.05）。结论 排石冲剂能有效减少高龄肾结石大鼠TGF-β1、KIM-1的产生，减轻肾脏氧化应激及炎症损伤，抑制结石形成。

排石冲剂尿路结石转化生长因子β1肾损伤分子

【Abstract】Objective：To investigate the effects of Paishi Granule on TGF-β1 and KIM-1 in elderly rats with renal calcium oxalate stone.Methods：A total of 40 SPF level elderly male Wistar rats were separated into 4 groups by random number table methods，including the normal group，the model group，Potassium citrate-treated group and Paishi granule-treated group（n=10 for each）.The rat model of renal calcium oxalate stone was induced by intragastrically administrated 2%ammonium chloride（AC），together with 1%ethylene glycol（EG）for free drink.At the same time，each group was treated with corresponding drugs.Individual weight and urine volume were recorded.The paraffin sections of kidney were prepared for observing the calcium oxalate deposit under the microscope.The levels of TGF-β1and KIM-1 in peripheral blood and renal tissues were detected by enzymelinked immunosorbent assay and immunohistochemistry.Results：24 h urine volumes in Potassium citrate-treated group and Paishi granule-treated group were significantly higher than those in normal group and model group（P＜0.05），despite a non-significant difference between Potassium citrate-treated group and Paishi Granule group（P＞0.05）.The scores of calcium oxalate crystallization in the two treated groups were significantly higher than that in the normal group，conversely，lower than the model group（P＜0.05）.Furthermore，the score in Paishi granuletreated group was lower than that in Potassium citrate-treated group（P＜0.05）.The levels of TGF-beta 1 and KIM-1 in serum and renal tissue of Potassium citrate group and Paishi Granule group were significantly lower than those in the model group（P＜0.05）.Compared with those in potassium citrate group，The levels of TGF-beta 1 and KIM-1 of Paishi Granule group were significantly decreased（P＜0.05）.Conclusion：Paishi granule can reduce the produce of TGF-β1 and KIM-1 in elderly rats with renal calcium oxalate stone，reduce renal oxidative stress and inflammatory damage，and inhibit the formation of stones.

【Key words】Paishi Granule；Urinary calculi；TGF-β1；KIM-1

尿路结石是临床常见病、多发病，全球患病率为1%～20%，我国为0.12%～6.02%。近二十多年来，微创外科技术在临床应用较广泛，但存在操作复杂、费用高、治疗不彻底、对肾组织有损伤、结石复发率高等弊端。尤其是高龄结石患者，上述弊端更明显。中药排石冲剂在临床30余年的应用中，取得了显著疗效［1］。笔者前期研究表明，排石冲剂可以显著降低尿路结石患者血清MDA、8-OHdG水平，升高SOD水平［2］，其机理可能与排石冲剂能有效减轻机体氧化应激损伤有关。为进一步探讨其作用机制，本实验以高龄草酸钙肾结石大鼠为模型，观察了排石冲剂对大鼠血清及肾组织转化生长因子β1（TGF-β1）、肾损伤分子（KIM-1）表达的影响。

1　材料与方法

1.1实验动物SPF级健康雄性Wistar大鼠40只，周龄18～20周，体质量（200±20）g，购自湖北省实验动物研究中心，实验动物使用许可证号：SCXK（鄂）2011-0003。

1.2药物与试剂排石冲剂由湖北省中医院制剂中心提供，组成：金钱草30 g，海金沙15 g，鸡内金15 g，王不留行15 g，滑石15 g，生牡蛎10 g，冬葵子15 g，白芍15 g，甘草5 g，石韦20 g，川楝子15 g等。TGF-β1、KIM-1酶联免疫吸附测定试剂盒及 TGF-β1、KIM-1免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程公司。

1.3造模及给药40只Wistar大鼠在恒温自然昼夜光照的环境中，适应性饲养1周后，采用随机数字表法分为4组，每组10只。正常组：给予0.9%氯化钠溶液灌胃，每日2 mL；模型组：给予1%乙二醇自由饮水和2%氯化铵溶液灌胃（成石剂）［3-5］，每日2 mL；枸橼酸钾组：给予成石剂及25%枸橼酸钾溶液灌胃，每日2 mL；排石冲剂组：给予成石剂及排石冲剂配成1.2 g/mL的混悬液灌胃，每日2 mL。各组大鼠均在相同条件下饲养，实验周期为4周（用1%乙醇自由饮水和2%氯化铵灌胃造肾结石模型的预实验，均造模成功。因本研究旨在观察排石冲剂对结石的预防作用，故造模和治疗同时进行）。

1.4标本采集及检测各组实验结束时，将大鼠置于代谢笼，收集24 h尿液并计量，加防腐剂 （甲苯，用量1.0～2.0 mL甲苯/100 mL尿液），4℃保存备用；将大鼠称质量后，10%水合氯醛按0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉，经腹主动脉采集血液标本，静置离心后，留取淡黄色上清液（血清）备用；取左肾置4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，作常规切片（厚度为2 μm）。

1.4.1一般情况观察大鼠的体毛、小便、体质量、饮食、精神及活动情况等。

1.4.2血清TGF-β1、KIM-1检测采用酶联免疫吸附法检测 （均按试剂盒说明操作），肾组织TGF-β1、KIM-1采用免疫组化法测定（均按试剂盒说明操作）。

1.4.3肾脏结晶沉淀检测石蜡切片分别做HE染色和Von Kossa染色。每只大鼠选取5张切片，于每张切片肾皮质处随机选5个视野，观察草酸钙结晶，以每个视野的平均值来表示该片的结晶，按形态分级评分法进行评分［6］：0分=无结晶；1分=有散在的结晶亮点；2 分=广泛的不成堆或局限结晶；3分=有成堆结晶散在不连接；4分=结晶成堆且互相连接；5分=广泛成堆结晶，连接成片。

1.5统计学处理应用SPSS20.0统计软件处理。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验，结晶评分组间比较采用Kruskal-Wallis检验，两两比较采用Nemenyi检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1各组一般情况见表1。正常组、模型组、枸橼酸钾组和排石冲剂组大鼠造模前4周毛色、小便、体质量、食欲、活动均未见明显变化；模型组第3周后大鼠出现毛色杂乱，食欲减退，饮水减少，尿量减少，精神倦怠，活动度减少。而枸橼酸钾组和排石冲剂组大鼠，尿量增加，精神状况良好，饮食活动基本正常。4组大鼠体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。4组大鼠24 h尿量比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；枸橼酸钾组和排石冲剂组均高于正常组和模型组（P＜0.05）；枸橼酸钾组与排石冲剂组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1　各组大鼠体质量及24 h尿量比较（±s）

表1　各组大鼠体质量及24 h尿量比较（±s）

与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05。下同。

组　别　n　体质量（g）　24 h尿量（mL）正常组　10　201±18　15.3±0.6模型组　10　180±20　14.5±4.9枸橼酸钾组　10　192±16　20.4±6.3*△排石冲剂组　10　195±16　23.1±5.8*△

表2　各组大鼠血清TGF-β1、KIM-1水平比较（±s）

表2　各组大鼠血清TGF-β1、KIM-1水平比较（±s）

与枸橼酸钾组比较，▲P＜0.05。下同。

组　别　n　TGF-β1（μg/mL）　KIM-1（ng/mL）正常组　10　1.52±0.36　4.32±1.41模型组　10　4.52±0.61**　12.84±3.22**枸橼酸钾组　10　2.88±0.34*△　8.63±2.11*△排石冲剂组　10　1.95±0.21*△▲　5.86±1.64*△▲

2.2各组大鼠血清中TGF-β1、KIM-1水平的比较见表2。4周末时，模型组、枸橼酸钾组、排石冲剂组大鼠血清TGF-β1、KIM-1水平均高于正常组 （P＜0.01 或P＜0.05）。枸橼酸钾组、排石冲剂组血清TGF-β1、KIM-1水平明显低于模型组（P＜0.05）。与枸橼酸钾组比较，排石冲剂组血清TGF-β1、KIM-1水平显著下降（P＜0.05）。

2.3排石冲剂对肾组织TGF-β1、KIM-1水平的影响见表3。免疫组化结果显示，正常组TGF-β1表达较少，模型组在肾小球系膜细胞、肾小管、肾间质中均有明显阳性表达（显示结果为棕色区域），枸橼酸钾组和排石冲剂组较模型组轻，见图1。正常组KIM-1在肾小管中表达较少，而模型组肾小管有阳性表达（显示结果为棕色区域），枸橼酸钾组和排石冲剂组KIM-1表达较模型组明显减少，见图2。与模型组比较，排石冲剂组及枸橼酸钾组TGF-β1、KIM-1表达累积光密度值下降（P＜0.05），且排石冲剂组低于枸橼酸钾组（P＜0.05）。

2.4各组大鼠肾组织中结晶形成情况见表4。4组间结晶评分比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；其中，枸橼酸钾组和排石冲剂组草酸钙结晶评分高于正常组，低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；排石冲剂组低于枸橼酸钾组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3　各组大鼠TGF-β1和KIM-1表达累积光密度定量比较（μm2，±s）

表3　各组大鼠TGF-β1和KIM-1表达累积光密度定量比较（μm2，±s）

组别　n　TGF-β1　KIM-1正常组　10　1498±110.5　28.8±6.4模型组　10　2060±152.7**　67.4±8.2**枸橼酸钾组　10　1780±98.6*△　38.6±5.1*△排石冲剂组　10　1640±82.1*△▲　31.6±4.4*△▲

图1　各组大鼠肾组织TGF-β1的表达（SP法，200倍）

图2　各组大鼠肾组织KIM-1的表达（SP法，200倍）

表4　各组大鼠肾组织草酸钙结晶评分比较（±s）

表4　各组大鼠肾组织草酸钙结晶评分比较（±s）

组别　n 结晶评分正常组　10模型组　10枸橼酸钾组　10 0.13±0.11 3.24±1.67*1.52±1.04*△排石冲剂组　100.42±0.26*△▲

3　讨　论

尿路结石属于中医“石淋”“砂淋”“腰痛”等范畴。以清热利湿活血法治疗尿路结石的新型纯中药制剂排石冲剂［7］，全方组成包括金钱草、海金沙、鸡内金、王不留行、滑石、生牡蛎、冬葵子、白芍、甘草、石韦、川楝子，已在临床应用30余年。前期临床研究表明：排石冲剂治疗尿路结石总有效率86%，能有效提高结石排出率，缩短结石排出时间，改善临床症状及阳性体征，无毒副作用［1］。

尿路结石80%为含钙结石，其中又以草酸钙为主要成分，占到80%［8］。草酸不仅以草酸钙结晶的形式参与结石的形成，而且高浓度的草酸、草酸钙晶体会诱导肾上皮细胞氧化应激及炎症损伤，损伤的肾上皮细胞为结石晶体的黏附提供了条件，同时产生的细胞碎片促进草酸钙结晶的核化和聚集。因此肾上皮细胞氧化应激及炎症损伤是结石形成的关键环节［9-10］，也是结石容易复发的原因之一。我们前期研究表明排石冲剂能有效防治尿路结石，其机理可能与排石冲剂能有效减轻机体氧化应激损伤有关［2］。研究证实，草酸、草酸钙结晶对肾上皮细胞氧化应激及炎症损伤的机理主要包括：1）产生大量TGF-β1，激活NADPH氧化酶，诱导大量活性氧簇（ROS），引起谷胱甘肽（GSH）氧化-还原失衡，导致肾上皮细胞自身凋亡、坏死［11-12］。2）激活NF-κB等，诱发肾脏上皮细胞产生一系列细胞因子，如KIM-1等，引发自身的炎症反应［13-14］。3）激活肾素、血管紧张素系统，加重氧化应激损伤及炎症反应等［15］。由此，本实验以高龄草酸钙肾结石大鼠为模型，观察排石冲剂对TGF-β1、KIM-1表达的影响，来进一步探讨排石冲剂治疗尿路结石的作用机理。

本实验肾组织病理切片显示模型组、枸橼酸钾组和排石冲剂组大鼠肾脏内均有不同程度的草酸钙结晶，说明制作草酸钙结石大鼠模型是成功的。排石冲剂组草酸钙结晶数量明显低于模型组（P＜0.05），草酸钙结晶在肾脏的沉积面积明显缩小，肾小管水肿明显改善，而且观察到排石冲剂组大鼠一般情况明显好于模型组，说明排石冲剂能有效防治尿路结石，并改善肾功能。本实验结果进一步显示模型组、枸橼酸钾组、排石冲剂组大鼠血清及肾组织TGF-β1、KIM-1水平均高于正常组（P＜0.05或P＜0.01），提示结石形成与肾氧化应激及炎症损伤密切相关，这与以往的研究报道一致。同时研究结果还表明排石冲剂组大鼠血清及肾组织TGF-β1、KIM-1水平明显低于模型组（P＜0.05），说明排石冲剂能减少机体TGF-β1、KIM-1的产生，从而维持GSH氧化-还原平衡，有效减轻肾脏氧化应激及炎症损伤，抑制结石形成。

综上所述，肾脏氧化应激及炎症损伤在肾结石发病过程中发挥重要作用，排石冲剂能有效减少高龄肾结石模型的TGF-β1、KIM-1的产生，减轻肾脏氧化应激及炎症损伤，为该方能更广泛应用于高龄尿路结石患者，提供必要的理论依据。

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Effects of Paishi Granule on TGF-β1 and KIM-1 in Elderly Rats with Renal Calcium Oxalate Stone

LUO Junhua，WEI Jinxia.Wuhan General Hospital of PLA Guang-zhou Military Command，Hubei，Wuhan 430070，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）05-0842-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.027

武汉总医院青年基金项目（YZ201524）

2016-01-11）