电针配合威灵仙关节腔内注射对大鼠膝骨关节炎MMPs及HA的影响*

孙建琴　陈红英　姚忠红　穆敬平　郭俐宏（湖北省十堰市太和医院，湖北医药学院附属医院，湖北 十堰 442000）



电针配合威灵仙关节腔内注射对大鼠膝骨关节炎MMPs及HA的影响*

孙建琴陈红英姚忠红穆敬平△郭俐宏
（湖北省十堰市太和医院，湖北医药学院附属医院，湖北 十堰 442000）

目的 探讨电针配合威灵仙膝关节腔内注射对大鼠膝骨关节炎基质金属蛋白酶（MMPs）及关节液透明质酸（HA）影响的作用机制。方法 将40只大鼠随机分为对照组、电针组、关节腔注射组、电针+关节腔注射组，采用膝关节腔内注射弗氏剂的方法建立膝骨关节炎动物模型；电针组取三阴交、足三里、行间、血海、太冲、阳陵泉及主穴以下旁开0.5 cm为配穴电针刺激20 min，关节腔注射组于关节腔内注射威灵仙注射液；电针+关节腔注射组治疗方法为电针+关节腔注射；观察膝关节肿胀率及消肿时间，采用酶免疫吸附试验测定血清MMPs（MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13）阳性表达水平，关节腔积液中白介素（IL-1β）、HA含量。结果 与电针组及关节腔注射组比较，电针+关节腔注射组膝关节肿胀率、消肿时间、MMP-1、MMP-9表达水平明显降低，HA明显提高（P＜0.05）。结论 电针配合威灵仙膝关节腔内注射治疗大鼠膝骨关节炎的作用机制可能与抑制MMPs过度表达并增加HA分泌而促进局部炎症吸收，延缓关节软骨退行性变相关。

膝骨关节炎电针关节腔注射威灵仙基质金属蛋白酶透明质酸

膝骨关节炎（KOA）属中医学“筋痹”“骨痹”范畴。中医学认为膝骨关节炎发病与血瘀气滞、关节局部湿浊痹阻有关。外伤、关节滑膜劳损、感染等炎性及疼痛刺激使膝骨关节面滑膜毛细血管扩张、通透性增大而导致关节腔内组织液大量渗出而成关节积液［1］。以往治疗时多局限于“舒筋通络、除痹利湿、行气止痛、活血化瘀”［2］。本实验研究采取电针配合威灵仙膝关节腔内注射的方法治疗大鼠膝骨关节炎，研究该方案对造成膝骨关节炎疼痛的病理基础，即MMP阳性表达及HA分泌与炎性疼痛的相互关系，分析治疗膝骨关节炎的镇痛消炎作用机制，为临床提供理论基础。现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物及分组SP F级无特定病原体动物SD大鼠40只，体质量（200.0±20.0）g，雌雄各半，由湖北医药学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证：SCXK（鄂）2014-0008，实验动物设施使用许可证：SYXK（鄂）2014-0031。采用随机数字表编号，随机分为对照组、电针组、关节腔注射组及电针+关节腔注射组，每组10只。

1.2试药与仪器复方威灵仙注射液（太和医院药剂科制剂中心提供），药方：威灵仙1000 g，独活500 g，柴胡500 g，白芷500 g，川芎500 g，氯化钠8 g，亚硫酸氢钠1 g。弗氏完全佐剂（上海实生细胞生物技术有限公司）；MMPs测试盒 （上海森雄科技实业有限公司）；SDZ-Ⅱ型电子针疗仪（上海坤弘，型号：SDZ-Ⅱ）。

1.3模型制备碘伏消毒大鼠膝关节及以下部位，采用改良Huhh造模法制备膝骨关节炎动物模型［3］。造模时于第1、3、7日分别将弗氏完全佐剂0.1 mL注入大鼠右膝关节腔，根据临床超疲劳易导致膝骨关节炎发病的特点，强迫动物每日活动30～40 min，于2周后出现以下症状即可确定大鼠膝关节炎模型成功：1）关节出现红、肿、热、痛症状，有右膝软组织肿胀或关节腔积液现象；2）右膝关节活动受限、周围僵硬；3）发病部位在膝等关节；4）关节积液检查白细胞介素-1β降低、HA明显升高现相；5）关节病理切片显示关节软骨面粗糙、滑膜增生、粘连、肥厚；6）出现以上任意3条均可判定为膝骨关节炎。

1.4治疗方法1）电针组：将大鼠固定于大鼠固定器，右膝遁经取穴，三阴交、足三里、行间、血海、太冲、阳陵泉为主穴。针法：由内向外斜刺2～3分。主穴以下旁开0.5 cm为配穴，行导气手法用一次性无菌针灸针齐刺入骨膜，以三阴交、足三里、行间、血海、太冲、阳陵泉为正极，配穴为负极，得气后接 SDZ-II型电子针疗仪，连续波，频率10 Hz，留针电针刺激20 min。2）关节腔注射组：于右膝关节腔内注射威灵仙注射液，每日1次，每次0.1～0.2 mL。3）电针+关节腔注射组：先同电针组相同治疗完成后，于右膝关节腔内注射威灵仙注射液。4）对照组：大鼠每日仅消毒处理作为对照。以上4组动物治疗2周为1个疗程。

1.5标本采集及检测参考文献［4］，大鼠眼眶静脉取血，采用免疫酶连吸附试验 （ELISA）测定MMPs （MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13）血清中的表达水平；抽取膝关节腔关节积液备用，测定关节积液中IL-1β、HA含量。按文献［5］方法：先取100 mL量筒注入蒸馏水，液面与量筒最高处平齐，用50 mL注射器吸取量筒内蒸馏水约30 mL。于每只大鼠右前肢膝关节缝矢状面用记号笔做一标记，然后把大鼠左足缓慢伸入量筒内，使标记与量筒最高处平齐。再用已吸入30 mL水的注射器向量筒内缓慢注入蒸馏水并使液面再次与最高处及大鼠膝关节标记处一致，读取注射器内剩余液体体积，再用30 mL注射器内剩余液体体积即为大鼠的右前肢膝关节容积，重复3次取平均值。右前肢膝关节肿胀百分率（%）=（造模后容积-造模前容积）/造模前容积×100%。

1.6统计学处理采用SPSS17.0统计软件处理。实验数据以（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，组间差异采用Dunnett检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1各组动物足肿胀度及消肿时间见表1。治疗后电针组、关节腔注射组足肿胀度及消肿时间均低于本组治疗前及对照组（P＜0.05），但两组治疗后比较差异无统计学意义（P＞0.05）。电针+关节腔注射组足肿胀度及消肿时间明显低于电针组及关节腔注射组 （P＜0.05）。

表1　各组大鼠足肿胀度及消肿时间比较（±s）

表1　各组大鼠足肿胀度及消肿时间比较（±s）

与本组治疗前比较，△P＜0.05；与对照组治疗后比较，▲P＜0.05；与电针组比较，#P＜0.05；与关节腔注射组比较，*P＜0.05。下同。

组别　n　消肿时间（d）足肿胀度（%）治疗前　治疗后对照组　10　45.92±3.90 34.21±3.32　13.79±4.78电针组　10　10.33±2.32△▲关节腔注射组　10　8.54±2.21△▲#47.41±4.33 28.34±3.17△▲48.29±3.88 16.39±2.47△▲#电针+关节腔注射组　10　6.34±1.49#*46.27±4.03 10.30±1.36#*

2.2各组动物治疗前后IL-1β及HA表达水平比较见表2。电针组HA有一定的升高，IL-1β有降低趋势，但与本组治疗前及对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），关节腔注射组IL-1β明显降低，HA明显升高（P＜0.05）；与电针组及关节腔注射组比较，电针+关节腔注射组IL-1β明显降低，HA明显升高（P＜0.05）。

表2　各组治疗前后大鼠HA、IL-1β表达水平比较（±s）

表2　各组治疗前后大鼠HA、IL-1β表达水平比较（±s）

组　别　时间　HA（μg/L）　IL-1β（pg/mL）对照组　治疗前　1.72±0.35　41.28±5.30 （n=10）　治疗后　1.93±0.27　42.50±5.22电针组　治疗前　1.68±0.25　39.89±4.53 （n=10）　治疗后　1.89±0.24　37.31±3.49关节腔注射组　治疗前　1.70±0.34　41.45±5.20 （n=10）　治疗后　0.72±0.09△▲#20.34±2.40△▲#电针+关节腔注射组　治疗前　1.68±0.37　40.73±5.24 （n=10）　治疗后　0.49±0.06#*　13.34±1.47#*

2.3各组动物治疗前后MMPs表达水平比较见表3。对照组大鼠血清MMPs各指标治疗后仍保持在较高水平，与对照组及治疗前比较，电针组及关节腔注射组MMP-1、MMP-9表达水平均降低（P＜0.05）。电针+关节腔注射组MMP-2、MMP-3、MMP-13均有一定程度降低，但与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。MMP-1、MMP-9表达水平则显著降低，与电针组及关节腔注射组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表3　各组治疗前后大鼠MMPs表达水平比较（ng/L，±s）

表3　各组治疗前后大鼠MMPs表达水平比较（ng/L，±s）

MMP-10　MMP-13 65.67±5.34 81.31±7.81 61.52±5.39 78.27±7.24 63.65±5.37 82.20±8.02 （n=10）　治疗后　76.±6.82△▲　78.9±7.32 60.7±5.39　53.7±5.02△▲　59.2±4.29　79.2±7.29关节腔注射组　治疗前　92.70±8.21　79.21±6.84 61.79±5.57 76.10±7.62　65.01±5.37 80.73±7.71 （n=10）　治疗后　70.80±6.81△#▲75.22±6.31 58.30±4.92 44.87±3.68△#▲61.74±5.12 77.27±6.21电针+关节腔注射组　治疗前　91.52±8.72　80.27±7.21 63.27±5.27 77.20±7.42　63.54±5.98 82.79±7.28 （n=10）　治疗后　52.81±4.82#*76.20±6.97 59.60±4.29 35.30±2.74#*59.79±5.34 78.27±7.02组别　时间对照组　治疗前（n=10）　治疗后电针组　治疗前MMP-1　MMP-2　MMP-3 93.28±8.76　80.21±7.17 62.72±5.45 89.34±8.07　76.25±6.19 59.35±5.24 94.78±8.87　81.21±7.84 63.79±5.52 MMP-9 79.17±7.62 76.02±6.81 77.10±6.67

3　讨　论

威灵仙注射液由毛莨科植物威灵仙干燥根及根茎，经加工提取的灭菌溶液，内含常春藤皂苷元及齐墩果酸等成分，具有消炎抑菌、清热解毒、强心利尿之功效［6］。《本草纲目》记载威灵仙“味微辛咸、通经络、消痰涎、祛风湿、散癖积，药性辛散温通，通行十二经脉，既能祛风湿，又能通经止痹痛”［7］。膝骨关节炎常出现关节积液，其病理改变为关节腔及滑膜炎性浸润，造成关节面软骨被破坏、变性并继发滑液炎症，是关节软骨细胞的分解与合成代谢紊乱造成的慢性、退行性关节疾病［8］。临床上多发于35岁以上的中年人，临床以膝关节疼痛、变形和活动受限为主要特点，目前治疗办法多以抗炎消肿为主，但疗效并不理想［9］。中医学认为，当膝关节因外伤或其他原因受损伤后，局部关节血瘀气滞，湿浊之气痹阻于膝，针灸治疗当以舒筋通络、行气止痛，中药内服外敷治疗当以活血化瘀、利湿除痹而达到临床治愈的目的［10］。

研究表明，软骨细胞外MMPs的病理性降解可导致膝骨关节炎发生［11］，MMPs有20多种，但在膝骨关节炎病理改变则以MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13表达异常增高为主，其中MMP-1、MMP-9是胞外基质降解的主要蛋白水解系统［12］，MMP-1、MMP-9与膝骨关节炎发生密切相关［13］，同时，正常的骨关节滑液中仅含有微量的IL-1β，当膝骨关节炎发生时IL-1β则会异常增高。HA可减少膝关节炎关节内PGE2等炎性介质的合成及扩散，减少滑膜的通透性及关节内渗液［14］。故本实验研究以MMPs、IL-1β、HA等主要指标评价电针配合威灵仙注射液治疗大鼠膝骨关节炎的影响。

本实验中选用三阴交、足三里、行间、血海、太冲、阳陵泉等诸穴，是因为阳陵泉可强筋祛湿，主治膝痹；足三里具有养血益气之功效，主治下肢痿痹；而血海穴主活血，与阳陵泉及足三里配伍具有舒筋活络、利通关节之奇效［15］。实验数据显示，电针+关节腔注射组大鼠MMP-1、MMP-9表达水平、IL-1β及左足趾关节肿胀率明显降低，消肿时间明显低于电针组、关节腔注射组。这可能与电针刺激可激发经气，促进局部血液循环及局部病变组织新陈代谢，降低痛阈、减轻关节滑膜表面神经末梢对炎性因子IL-1β刺激的反应敏感度有关，故其关节肿胀率明显降低，消肿时间缩短。电针+关节腔注射组HA较单用电针刺激及威灵仙关节腔注射组增高明显，IL-1β进一步降低，这可能是威灵仙吸收后明显抑制MMP-1MMP-9产生，促使滑膜内衬B型滑膜细胞和单核吞噬细胞大量分泌HA，达到润滑关节、延缓软骨退变及保护关节软骨的作用。MMP-1、MMP-9产生降低可减轻MMPs对关节组织细胞外基质降解，减轻IL-1β对关节表面软骨细胞的破坏作用。

综上所述，电针刺激配合威灵仙注射液膝关节腔内注射对大鼠膝骨关节炎有明确的治疗作用，促进局部组织血液循环及新陈代谢，明显降低MMP-1、MMP-9对关节组织细胞外基质降解及IL-1β对膝关节的破坏，延缓关节软骨退行性变，提高大鼠对炎症因子IL-1β等刺激的痛阈，增加HA对膝关节润滑及保护作用。

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Experimental Study on Effects of Electroacupuncture Combined with Weilingxian Intra-articular Injection on MMPs and HA in Rats with Knee Osteoarthritis

SUN Jianqin，CHEN Hongying，YAO Zhonghong，et al.Taihe Hospital of Shiyan，Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine，Hubei，Shiyan 442000，China.

【Abstract】Objective：To investigate the effect and mechanism of electro acupuncture combined with Weilingxian intra-articular injection on MMPs and HA in rats with knee osteoarthritis.Methods：40 rats were randomly divided into the control group，electroacupuncture group，Weilingxian group，electroacupuncture plus acupoint injection group.Osteoarthritis animal model was established with the method of intra articular injection of the knee joint.Electroacupuncture group took electroacupuncture below 0.5 cm of Zusanli，Sanyinjiao and Xingjian，Xuehai，Taichong，Yang Ling Quan and the main points for 20 minutes.Weilingxian group took intra-articular injection of Weilingxian.Electroacupuncture plus acupoint injection group received both treatment above.The knee swelling rate and joint swelling time were observed，and the following data was determined by enzyme-linked immunosorbent assay：positive expression level of serum MMPs（MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，MMP-13），IL-1β in articular effusion and the content of HA.Results：Knee joint swelling rate，swelling time of MMP-1，MMP-9 expression levels in electroacupuncture plus point injection group were significantly lower than those of Weilingxian group，and HA was obviously improved（P＜0.05）.Conclusion：The mechanism of electroacupuncture combined with knee intra-articular injection of Weilingxian on knee osteoarthritis in rats should be related to the inhibition of overexpression of MMPs and the increase the secretion of HA，so as to promote inflammation absorption and delay cartilage degenerative change.

Kneeosteoarthritis；Acupuncture；Acupointinjection；Weilingxian；Matrixmetalloproteinases；Hyaluronic acid

R245.9+7

A

1004-745X（2016）05-0791-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.012

湖北省科技厅项目（2013cfc037）
△

（电子邮箱：2051494669@qq.com）

2016-01-09）