广西良种杉木组培育苗快繁技术体系的优化*

蔡玲，吴幼媚，黄金使，黄艳，黄宏喜，韦理电，蒙江春

(1.广西林业科学研究院,广西　南宁530002；2.国家林业局中南速生材繁育实验室，广西　南宁530002；3.广西优良用材林资源培育重点实验室，广西　南宁530002;4.南宁树木园，广西　南宁530031；5.华山林场，广西　环江547106)



广西良种杉木组培育苗快繁技术体系的优化*

蔡玲1，2，3，吴幼媚1，2，3，黄金使1，2，3，黄艳4，黄宏喜1，2，3，韦理电5，蒙江春5

(1.广西林业科学研究院,广西南宁530002；2.国家林业局中南速生材繁育实验室，广西南宁530002；3.广西优良用材林资源培育重点实验室，广西南宁530002;4.南宁树木园，广西南宁530031；5.华山林场，广西环江547106)

以广西良种杉木优良无性系—柳327幼林萌芽条为外植体，通过采用正交设计方法对培养基激素组合、培养室光照强度和温度等杉木快繁条件进行优化。结果表明：继代丛芽转接时，丛芽中高≥1.3cm的单芽全部切除，接种于改良1/2 MS+6-BA 0.7mg/L+KT 0.3mg/L+IBA 0.1mg/L培养基内，培养35d，芽增殖系数达5.2，有效芽38株/瓶(500mL三角瓶)；将高≥1.3cm的组培单芽扦插于改良1/2 MS+KH2PO4100 mg/L+IAA 3mg/L+IBA 2mg/L+ABT60.8mg/L培养基内，然后置于温度20～25℃，光照2 500～6 000Lx的培养环境条件下，培养45d，平均生根率达98.3%，根系数量为5.6条/株。经过优化的杉木组培育苗体系达到了产业化生产的需求，为广西良种杉木的快速繁育提供了技术支撑。

杉木；良种；组培苗；继代培养；有效芽

杉木(Cunninghamialanceolata)是我国特有的重要造林用材树种，具有速生、丰产、材性好和用途广等优良特性，在中国人工林中具有重要的地位[1～2]。随着中国木材供需矛盾的突出，木材战略储备基地的建设，杉木的发展得到了高度重视，在杉木适生区正掀起一股人工林营造的高潮，良种苗木远远不能够满足市场的需求。杉木组织培养技术研究及推广应用方面已有大量的报道。国内学者相继报道了杉木组培嫩梢增殖与复壮的分析[3]，杉木组织培养繁殖体系建立研究[4]，杉木离体培养中的钙、镁效应[5]，杉木优树大量繁殖技术研究[6]，杉木优良无性系组培快繁技术体系的建立[7]及速生优良杉木组培继代及生根培养研究[8]等内容的研究。本文以广西杉木优良无性系为研究对象，针对广西良种杉木组培育苗过程中芽继代培养增殖系数低，组培单芽扦插生根率低等问题，在蔡玲等杉木继代芽增殖培养技术[9]和吴幼媚等杉木优良无性系柳327组培不定根诱导技术[10]的研究基础上，通过采用正交设计方法对培养基激素组合、培养室光照强度和温度等条件进行优化，旨在进一步提高组培继代芽增殖系数和单芽扦插生根率，以增加杉木良种组培苗的生产量，降低其生产成本。

1　材料与方法

1.1材料

组培材料来自广西林业科学院科技成果转化中心，是以贺州黄洞林场的3年生杉木良种柳327嫁接无性系的幼林萌芽条为外植体，获得其组培苗。

1.2方法

1.2.1芽增殖培养基的优化试验

在基本培养基改良1/2 MS培养基〔MS+200mg/LCa(NO3)2〕的基础上，设计4个因素：6-BA、IBA、KT和VH(生物素)，3个水平，采用正交设计L9(34)布置试验。共设计9个处理(表1)，每个处理接种30瓶(500mL的三角瓶)，每瓶接种芽5丛，每丛芽5～7株。重复3次，培养35d时统计新增芽数。芽增殖系数=新增芽数/接种芽总数。

表1　正交设计L9(34)试验芽生长直观分析

注：有效芽指继代芽的高度不小于1.3 cm，叶展开数15～20片。

1.2.2继代芽剪切方式的筛选

将继代芽按A(丛芽内，芽高≥1.3cm的芽全部切除掉)、B(丛芽内，芽高≥1.3cm的芽切掉1/2)和C(不切除芽，按5～7株/丛的量分丛)3种方法切除后接入瓶内，接芽5丛/瓶，每丛芽5～7株。每个处理接种30瓶，培养35d时记录有效芽数和芽生长发育的形态特征。有效芽的标准为高度≥1.3cm，叶展开数15～20片。

1.2.3生根培养基的优化试验

选择继代35d，高≥1.3cm的壮芽进行不定根诱导培养。生根培养基在改良1/2 MS培养基+IBA 2mg/L+IAA mg/L的基础上，添加一定量的ABT6和KH2PO4。采用正交设计L9(34)方法布置试验。9个处理(表2)，每个处理30瓶(200mL广口瓶)，每瓶扦插20个组培单芽，重复3次，培养45d时统计苗木的生根率。生根率=组培单芽生根数/组培单芽扦插总数×100%。

表2　正交组合优化单芽生根直观分析

1.2.4光照强度和温度对芽生根率的影响

将扦插好的壮芽分别置于光照强度为500～800Lx，1 000～2 000Lx，2 500～3 500Lx，2 500～6 000Lx，2500～7 000Lx，温度为10～15℃，20～25℃，30～35℃组合成的9个环境进行培养(表3)。每个处理接种30瓶，每瓶接种20个单芽，3次重复，45d时统计平均生根率。

表3　培养室的温度、光照条件对单芽生根影响的结果

注：同列内不相同字母表示经邓肯氏新复极差法检验在p=0.05水平上差异显著。

1.2.5其他培养条件

试验时间2014年1月1日-12月30日，增殖培养基内含30g/L蔗糖、琼脂粉4.6g/L，生根培养基内含20g/L蔗糖、琼脂粉5.6g/L用1mol/LNaOH或HCl将培养基调至pH6.8,120℃的高温和1.1Pa大气压条件下灭菌15min(增殖培养基)或20min(生根培养基)。除试验外，培养室温度25～28℃，光照1 000～6 000Lx，光照时间12～14h/d。

2　结果与分析

2.1芽增殖培养基的优化

杉木组培苗的继代芽在1～9号培养基内，培养35d新芽增殖结果见表1。由表1R1、R2可以看出，对芽增殖影响由大到小依次为，6-BA>KT>VH>IBA；对有效芽形成影响由大到小依次为：6-BA=VH>KT>IBA，说明6-BA对芽的增殖和有效芽的培养均起着主导作用；添加KT能提高芽细胞分裂能力，有利于芽的增殖；添加VH对有效芽的培养有比较明显的效果。从k1、k2来看,6-BA浓度为0.7mg/L、KT浓度为0.3mg/L、IBA浓度为0.1mg/L、VH浓度为60mg/L对芽的增殖系数和有效芽形成效果最好。根据正交试验结果，初步确定杉木组培苗的快繁技术体系应含有0.7mg/L 6-BA+0.3mg/L KT+0.1mg/L IBA+60mg/L VH。处理7的芽增殖系数和有效芽数分别为5.2和25株/瓶，由此可见，7号组合为本试验最理想的组合，6号次之，最差是1号组合，芽增殖系数和有效芽数分别仅2.5和5株/瓶。

2.2继代芽剪切的方式对有效芽生长的影响

杉木组培苗的继代芽转接到新培养基时，剪切的方式对有效芽生长的影响结果见图1。

3种剪切方式的有效芽平均数量由多到少依次为A(全部切掉芽)，B(芽切掉1/2)和C(不切除芽)。分析其原因，这是由于切除丛芽中一定量特定高度的单芽，增加了丛芽的透光度，降低了大芽对养分的消耗，有利于形成新的有效芽。

2.3生根培养基的优化

将高度≥1.3cm的单芽接种于1～9号处理组合的培养基内，培养45d时统计组培苗的生根结果(表2)。不同的药剂种类和浓度组合，组培单芽的生根率和苗木根系的数量存在差异。直观分析结果表明，4个试验因素，单芽生根率的R1极差大小排序为,IAA>ABT6>IBA>KH2PO4，苗木根系数量的R2极差大小排序为，IAA>ABT6>KH2PO4>IBA。分析结果表明，IAA对杉木组培单芽根系诱导和根系生长数量起着主导作用，IAA在1～3mg/L范围内，随着浓度的提高，平均生根率随之增加，7号组合的生根率达到98.2%，其IAA浓度为3mg/L。ABT6，IBA和KH2PO4对杉木组培单芽根系诱导和根系生长数量的影响相对IAA较弱。IBA对苗木生根率的影响大于KH2PO4，而对根系数量的影响小于KH2PO4，说明添加IBA比较有利于杉木单芽根系的诱导，添加KH2PO4比较有利于根系的生长。表2显示，7号组合生根效果最好，极差最大。根据正交试验结果，初步确定杉木组培苗快繁技术体系应包含3mg/L IAA、1mg/L IBA、0.8mg/L ABT6、100mg/L KH2PO4。7号组合单芽生根率达98.2%，根系数量5.6条/株，也属本试验的最大值。理论与实践结果一致。因此，7号组合是本试验最理想的组合，达到了杉木组培苗产业化生产的技术要求。

注：A为高≥1.3cm的芽全部剪除；B为高≥1.3cm的芽剪除1/2；C为不剪芽。

2.4培养室温度、光照强度对单芽生根的影响

将接种好的生根瓶苗分别置于9个光照强度和温度组合的环境中培养，苗木生长45d时统计生根率结果见表3。

表3结果显示，培养室温度和光照条件对单芽的生根率具有显著影响。试验9个组合，培养室温度偏低的1～3号组合，杉木组培苗的单芽始根时间最长，为27d；当培养室的温度处于杉木生长适宜温度20～25℃时，其单芽始根时间最短，15～19d，其中5号和6号组合15d。但当培养室温度处于杉木生长偏高的温度30～35℃时，苗木始根时间比组合4至组合6的平均始根时间长约6d。其单芽生根率大小排序为5>6>4>8>9>7>3>2>1。5号组合，单芽生根率高达98.3%，其次是6号，生根率90.3%。1号生根率仅23.2%。综上所述，不同培养温度对单芽生根率存在显著性差异，温度相同而光照强度不同，单芽生根率差异也显著，说明只有当培养室的温度处于杉木适宜生长温度时，光照方能发挥较大的作用，即杉木单芽高生根率，不仅需要适宜的温度条件，还需要较强的光照强度。本试验最佳生根培养环境条件：培养室温度20～25℃，光照强度2 500～6 000Lx；培养室温度20～25℃，光照强度2 500～7 000Lx次之。

3　结论与讨论

3.1结论

(1)6-BA对杉木组培苗芽的增殖起着主导作用，在6-BA浓度为0.7mg/L的基础上，添加0.3mg/L KT、60mg/LVH和0.1mg/L IBA，能有效地促进细胞的分裂，提高杉木继代芽的增殖系数，有效芽数量达到25株/瓶。

(2)继代芽培养到35d后，培养基内营养将耗尽时，苗木生长缓慢或停止生长，此时必须将培养物转接到新培养基上，否则苗木死亡。为了提高有效芽率，提高组培壮苗的产量，就继代芽丛的剪切方法进行试验，结果以A处理(全部切掉芽)效果良好，与不切芽相比较，其有效芽增加217%，大大降低了苗木生产的成本。A处理在芽转接时，将高≥1.3cm的组培单芽全部剪除，一方面降低了大芽对培养基营养的消耗，提高了芽的透光度，促进嫩芽光合作用，充分利用培养基的营养快速生长，增加了有效芽；另一方面通过切断芽的顶端优势，促进培养基细胞分裂素的循环速度，提高芽的增殖和生长。

(3)组培单芽不定根诱导和培养结果表明，IAA对杉木组培苗生根起着主导作用，在适宜IAA浓度的基础上添加适量的ABT6和IBA，能有效地促进其单芽不定根的发生。

(4)杉木较喜光，但幼树稍能忍耐侧方蔽荫。其生长量适宜的温度条件为年平均气温16～19℃，然而，温度条件偏高或偏低都不利于组培芽的生根。本试验结果充分证明：当培养室温度处于杉木生长偏低10～15℃时，芽活性下降，尽管将光照强度提高到2 500～3 500Lx，单芽的始根时间仍然较长，为27d，芽生根的效果不良，生根率仅41.6%。当培养室温度为20～25℃时，适宜杉木组培苗生长，芽活性强，提高光照强度，能有效地缩短始根时间，仅15d，生根率也达到本试验的最高值98.3%。

(5)本文通过组培快繁技术体系的优化，广西良种杉木组培快繁主要技术参数得到了有效提高。继代芽增殖系数从4.8/35d[9]提高到5.2/35d；有效芽从21株/瓶[9]提高到38株/瓶；生根率从97.1%[10]提高到98.3%。

3.2讨论

(1)为了降低苗木生产成本，在适宜IAA浓度的基础上，仅添加ABT6或IBA，能否使杉木单芽生根率达到98.2%，有待进一步的研究。

(2)杉木组培快繁技术研究中发现，增殖芽在继代过程中比较容易出现老化现象，造成组培苗造林后过早开花。如何通过改进组培技术，保持杉木组培增殖芽幼态化，延缓或遏制增殖芽老化有待进一步深入研究。

[1]俞新妥.杉木栽培学[M].福州:福建科学技术出版社，1997：58-69.

[2]俞新妥.杉木研究的特点及有关基础研究的综述[J].福建林学院学报，2000，20(1)：86-95.

[3]阙国宁.杉木组培嫩枝增殖与复壮的分析[J].林业科学研究，1989，2(6)：546-551.

[4]吴擢溪，李振问，吴大忠.杉木组织培养繁殖体系建立的研究[J].福建林学院学报，1991，11(1)：67-74.

[5]诸葛强，阙国宁.杉木离体培养中的钙、镁效应[J].林业科学研究，1992，5(1)：60-64.

[6]汪建亚，蒋祥娥，河野耕藏，等.杉木优树大量繁殖技术研究[J].南京林业大学学报，1999，23(1)：19-23.

[7]欧阳磊，郑仁华，翁玉榛，等.杉木优良无性系组培快繁技术体系的建立[J].南京林业大学学报，2007，31(3)：47-51.

[8]林景泉.速生优良杉木组培继代及生根培养研究[J].安徽农业科学，2011，29(15)：8933-8934.

[9]蔡玲，吴幼媚，俸元娇，等.广西良种杉木茎段组织培养继代芽增殖培养优化[J].广西林业科学，2013，42(2)：112-115.

[10]吴幼媚，蔡玲，王以红，等.杉木优良无性系柳327组培不定根诱导[J].广西林业科学，2013，42(3)：310-314.

The Production of Tissue Cultured Seedlings of Improved Varieties of Cunninghamia lanceolata

CAI Ling1,2,3,WU You-mei1,2,3,HUANG Jin-shi1,2,3,HUANG Yan4,HUANG Hong-xi1,2,3,WEI Li-dian5,MENG Jiang-chun5

(1.Guangxi Forestry Research Institute,Nanning Guangxi 530002,P.R.China;2.Key Laboratory of Central South Fast-growing Timber Cultivation of Forestry Ministry of China,Nanning Guangxi 530002,P.R.China;3.Guangxi Key Laboratory of Superior Timber Trees Resource Cultivation,Nanning Guangxi 530002，P.R.China;4.Nanning Arboretum, Nanning Guangxi 530031, P.R.China;5.Huashan Forest Farm, Huanjiang Guangxi 547106, P.R.China)

Using the clone of improved varieties ofCunninghamialanceolate,liu327 ,as the explant,several conditions such a hormone combination,light intensity,and temperature were optimized based on the method of orthogonal design in Guangxi in this study.The results showed that after subculture of 35 days,the proliferation of shoots was 5.2 fold and the number of effective buds was 38 plants per flask if single buds higher than 1.3 cm were cut off from clustered shoots and transferred to the modified 1/2MS medium + 0.7 mg/L 6-BA + 0.3mg/L KT + 0.1 mg/L IBA during the subculture of shoots.After rooting culture of 45 days with 20～25 ℃ temperature and 2 500～6 000Lx light intensity, the average of rooting percentage was 98.3%,each rooted plantlet has 5.6 roots and robust if single buds higher than 1.3 cm were cultured in the rooting medium with the modified 1/2MS medium+ 100 mg/LKH2PO4+ 3 mg/LIAA + 2 mg/LIBA + 0.8 mg/L ABT.This achieved the requirement for the commercial production of tissue cultured seedlings inCunninghamialanceolataand provided technical support for the rapid development of improved varieties ofCunninghamialanceolatain Guangxi.

Cunninghamialanceolata;improved varieties;tissue cultured seedlings;subculture;functional bud

2015-08-27

广西2014年林业项目中林木良种资金——林木种质资源保存与利用(桂农[2014]51号),广西林业科技项目(桂林科字[2012])。

蔡玲(1963-)，女，教授级高工，主要从事林木生物技术研究工作。E-mail：2496880519@qq.com

S 791.27

A

1672-8246(2016)04-0035-05

doi:10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.04.006