miR-424对非小细胞肺癌A549细胞生长和侵袭的影响及分子机制

李宏敏 兰海涛 张明 安宁 于瑞莲 何阳科 甘崇志

肺癌是近年来全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率逐年上升[1,2]。肺癌中约85%为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）[1]，其发病率在肺癌中居首位[2]，患者5年内生存率不足15%[2]。研究NSCLC的发生发展机制对肿瘤的诊断及预后有重要意义[3-6]。MicroRNA（miRNA）是在真核生物中发现的一类高度保守的非编码小RNA，在细胞生命活动的调控以及多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用[2]。研究表明，miR-424可通过靶定WEE1抑制肾癌细胞增殖[2]，miR-424能够抑制宫颈癌细胞细胞迁移和侵袭能力[1]，提示miR-424发挥着抑癌基因的作用，目前关于miR-424在NSCLC中的作用尚无相关研究。而有文章[15]指出，E2F6的低表达可能与宫颈鳞癌细胞的发生、发展、浸润有关。本研究旨在探讨miR-424是否影响NSCLC的生长和侵袭能力，并初步探索其分子机制是否与E2F6有一定关系。

1 材料与方法

1.1 材料 1640培养基、胎牛血清、Opti-MEM购自Gibco公司。免疫印迹化学发光系统购自Syngene公司。MMP-2和MMP-9的抗体购自Abcam公司。miR-424 mimics、miR-424 inhibitor购自Biomics公司，Trizol、逆转录试剂盒、PCR引物、Lipofectamine RNAi MAX购自美国Invitrogen公司。Transwell培养板购自Corning公司；Matrigel购自BD公司；X-tremeGENE购自罗氏公司。CCK8试剂购自日本同仁化学研究所。双荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司。肺癌细胞株A549由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 肺癌细胞A549培养于含10%FBS的1640培养基中，培养液含青霉素/链霉素100 U/mL将细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 细胞转染 取对数生长期的A549细胞，5×105个/孔细胞接种于6孔板中，37 ℃、5%CO2培养24 h后用Lipo2000分别转染miR-424 mimics、miR-424 inhibitor以及miRNA con于细胞中，每组设三个复孔。

1.2.3 实时定量RT-PCR检测miR-424的表达 用Trizol法提取转染48 h后的A549细胞总RNA，反转后进行RT-PCR反应，反应条件为：95 ℃，3 min；95 ℃，10 s ；60 ℃，30 s，40个循环。以U6为参照，进行分析。

1.2.4 CCK8检测细胞增殖 将转染48 h后的A549细胞培养基弃掉，每孔加入100 μL CCK8试剂和完全1640培养基的混合液（1：1），37 ℃、5%CO2培养箱孵育3 h后，测定490 nm波长处的吸光度值。

1.2.5 Transwell检测细胞的侵袭能力 将铺有基质胶的孔径8 μm的Transwell培养板置于37℃预热，将转染24 h的细胞消化，用无血清1640培养基洗涤两次，调整细胞密度为1×105个/mL，250 μL/孔，接种到Transwell上室中，下室加入800 μL含15%血清的1640培养液。37 ℃培养20 h，取出Transwell培养板，PBS洗涤后，在4%甲醛固定10 min，用1%结晶紫进行染色，显微镜下观察、照相。随机选取55个高倍视野（×200）计数每个视野下发生侵袭的细胞。

1.2.6 Western blot检测蛋白表达 取对数生长期的A549细胞，以1×107个/mL接种于10 cm2培养皿中，1 mL/盘，分别转染miR-424 mimics与miR-424 inhibitor，48 h后裂解细胞，收集蛋白进行Western blot检测。检测方法：将细胞用PBS洗涤后用加入预冷500 μL PBS，用细胞刮挂下细胞，1,000 rpm，4 ℃离心10 min，向沉淀中加入300 μL细胞裂解液裂解细胞提取总蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳分离，恒流300 mA转移至PVDF膜。5%脱脂牛奶封闭2 h后，加入一抗，4 ℃孵育过夜。次日PBST洗膜，二抗室温孵育2 h，PBST洗膜。用化学发光法显色，凝胶成像系统采集成像。

1.2.7 荧光素酶报告载体的构建 在Targetscan中找出可能与miR-424作用的E2F6的3'UTR序列，用Primer 5.0软件分别设计合成野生型与突变型E2F6的3'UTR的PCR引物。分别以A549细胞cDNA为模板进行PCR扩增。PCR产物纯化回收后与连接到pmirGLO vector载体上，测序鉴定，得到野生型与突变型荧光素酶报告载体：pmirGLO/E2F6-3’UTR与pmirGLO/E2F6-3’UTR mut。

1.2.8 双荧光素酶报告基因检测 将构建好的mirGLO/E2F6-3’UTR与pmirGLO/E2F6-3’UTR mut报告载体分别与miR-424 mimics、 miR-424 inhibitor以及miRNA con，用X-treme GENE转染试剂共转染到A549细胞中，48 h后裂解细胞，用双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性。测定实验组（A1）和海肾荧光素酶表达载体（A2）的活性，计算A1/A2比值表示相对荧光素酶活性。

1.2.9 统计学分析 应用SPSS 12.0软件进行统计学处理，数据采用Mean±SD描述，不同组间数据比较应用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-424对NSCLC细胞增殖能力的影响 为确定miR-424对NSCLC细胞增殖的影响，将miR-424 mimics、miR-424 inhibitor以及miRNA con分别转染A549细胞。RTPCR检测miR-424 的表达变化，验证miR-424转染效果如图1A所示；CCK8法检测细胞增殖情况。结果显示：与对照组相比，转染miR-424后，A549细胞增殖速率降低，而转染miR-424 inhibitor组A549细胞增殖速率提高，说明miR-424能够抑制NSCLC细胞的增殖（图1B）。

图1 miR-424对A549增殖能力的影响。A：miR-424转染效果；B：CCK8法检测A549细胞增殖速率。*：与对照组相比，P＜0.05。Fig 1 The effect of miR-424 on proliferation abilities in A549.A: Results of miR-424 transfection; B: The proliferation rate of A549 by CCK8.*:compared with the control, P＜0.05.

图2 miR-424对A549细胞侵袭能力的影响。A：显微镜计数结果；B：结晶紫染色法检测miR-424对A549侵袭能力的影响（×200）。*：与对照组相比，P＜0.05Fig 2 The migration abilities of miR-424 on A549.A: Results of microscope counting; B: The effects of miR-424 on migration abilities of A549 by crystal violet staining.*: compared with the control, P＜0.05.

2.2 miR-424对NSCLC细胞侵袭能力的影响 Transwell细胞侵袭实验结果如图2A、图2B，结果显示，与miRNA con组相比，转染miR-424组的A549细胞穿膜数降低（107.6±12.1vs45.7±6.6），而抑制miR-424表达后细胞的穿膜数提高（132.8±14.2）。说明miR-424能够抑制A549细胞的侵袭能力。

2.3 miR-424对NSCLC细胞中侵袭相关蛋白表达的影响 为探究miR-424对NSCLC细胞侵袭能力影响的分子机制，本研究检测了各转染组细胞中侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9的表达水平。结果显示，过表达miR-424后，两种蛋白表达水平降低，而抑制miR-424 的表达后，两种蛋白表达水平提高，结果如图3所示。

2.4 荧光素酶活性检测miR-424对E2F6靶序列的作用Targetscan分析得到E2F6上miR-424可能的靶向序列如图4所示，将构建的pmirGLO/E2F6-3’UTR与pmirGLO/E2F6-3’UTR mut荧光报告载体分别与miR-424共转染到A549细胞后，检测荧光素酶活性，结果如图4所示，过表达miR-424后能够下调野生型E2F6 3UTR的报告载体的荧光素酶活性，而抑制miR-424的表达后野生型E2F6 3’UTR的报告载体的荧光素酶活性上调，说明miR-424对E2F6有靶向作用。而转染突变型E2F6 3’UTR的报告载体组的荧光素酶活性没有明显降低。实验结果暗示miR-424能与E2F6 3’UTR互补结合。

2.5 miR-424负向调控NSCLC细胞中E2F6的表达 Western blot结果如图5所示，与对照组相比，转染miR-424后，A549细胞中E2F6的表达明显下调，而转染miR-424 inhibitor组细胞中E2F6的表达明显上调。

图3 miR-424对A549中MMP-2和MMP-9表达的影响Fig 3 The effects of miR-424 on the expression level of MMP-2 and MMP-9

图4 荧光酶素活性检测miR-424对E2F6靶序列的作用。A：Targetscan分析miR-424的靶向序列；B：miR-424对E2F6靶序列的作用。*：与对照组相比，P＜0.05。Fig 4 The role of miR-424 to the target sequence of E2F6 by detecting enzymatic activity.A: Targeting sequence of miR-424 by Targetscan analysising; B: The role of miR-424 to the target sequence of E2F6. *:compared with the control, P＜0.05.

图5 miR-424负向调控E2F6的表达。*：与对照组相比，P＜0.05。Fig 5 miR-424 can negatively regulating E2F6 expression.*:compared with the control, P＜0.05.

3 讨论

肺癌是目前全球范围内恶性肿瘤之一，NSCLC是最常见的肺癌类型，也是肺癌治疗的重点，研究表明，miRNA与多种癌症的发生发展密切相关[7]，且多种miRNA定位于基因组上与癌症相关的脆性位点[8]，说明其在癌症的发生过程中可能起着至关重要的作用。近年来大量的研究证实多种miRNA的异常表达与NSCLC密切相关[9]，如miR-138能够通过抑制PDK1而抑制NSCLC的增殖[10]，miR-21、miR-143及miR-181a的表达水平与NSCLC临床病理及预后密切相关[11]。

研究表明，miR-424在多种肿瘤中表达异常，其在不同肿瘤中发挥的作用也不同[12,13]，如miR-424能够通过抑制ChK1的表达而抑制宫颈癌的发展，可作为宫颈癌的潜在预后指标和治疗靶点，且miR-424与宫颈癌、胰腺癌和前列腺癌等多种肿瘤的侵袭密切相关[14]。本研究中，在NSCLC细胞中过表达miR-424后，细胞的生长和侵袭能力降低，提示miR-424在NSCLC可能发挥抑癌的作用。本研究中，在NSCLC细胞中过表达miR-424后，细胞侵袭能力降低，且侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9蛋白表达降低，说明miR-424能够抑制NSCLC细胞的侵袭。

为进一步研究miR-424调控NSCLC生长侵袭的分子机制，本研究利用双荧光酶活性实验验证了其直接靶基因-核转录因子E2F6。研究[15]表明，E2F6能够抑制DNA损伤引起的细胞凋亡，E2F6在宫颈鳞状细胞癌中表达下调，其可能与宫颈癌的发生发展密切相关。由于miR-424可抑制肾癌细胞增殖，抑制宫颈癌细胞迁移和侵袭能力，所以miR-424与癌症细胞的发生呈正相关关系；而E2F6的下调又能导致宫颈癌的发生；所以推测miR-424与E2F6呈负相关关系。而Western blot结果表明miR-424负向调控NSCLC细胞中E2F6的表达，与推测相符。但是由于E2F6的相关报道较少，在后续研究中，我们将对E2F6在NSCLC中发挥的功能及机制进一步研究。

综上所述，本研究表明，miR-424能够抑制NSCLC的生长和侵袭，其下游靶基因为E2F6。在后续研究中将深入探讨具体作用机制，研究这些为探索miR-424 在NSCLC中的作用机制以及参与的网络调控奠定基础，也为NSCLC的临床生物治疗提供新的治疗靶标。