不同锦鲤血液指标比较研究

2016-08-25王冬武邓时铭邹利李绍明蒋国民湖南省水产科学研究所湖南长沙4053湖南渔缘生物科技有限公司湖南长沙4053

水产养殖 2016年4期

王冬武，邓时铭，邹利，李绍明，蒋国民（.湖南省水产科学研究所，湖南　长沙　4053；2.湖南渔缘生物科技有限公司，湖南　长沙　4053）

不同锦鲤血液指标比较研究

王冬武1，2，邓时铭1，邹利1，李绍明1，2，蒋国民1
（1.湖南省水产科学研究所，湖南长沙410153；2.湖南渔缘生物科技有限公司，湖南长沙410153）

研究分析相同条件下锦鲤的血细胞、吞噬能力和酶活性指标，结果显示：红白锦鲤的红、白细胞数目最大，中性粒细胞对葡萄球菌吞噬百分比和NBT%最高，分别达到（46.75±3.39）%和（61±5.66）%；不同锦鲤的AKP、ACP、T-SOD差异无统计学意义。由此看出，不同锦鲤非特异性免疫能力、免疫过程不尽相同，红白和三色锦鲤先吞噬后胞内杀伤菌体，黄金则是直接溶解菌体来完成。

锦鲤；血液指标；比较研究

doi：10.3969/j.issn.1004-2091.2016.04.001

锦鲤是一种较低等的变温动物，机体特异性免疫能力较差，主要依靠非特异免疫来防御疾病，而非特异性免疫防御机制中，主要由具有吞噬活力的中性粒细胞及由相关细胞分泌的溶菌酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等起作用，其能力的高低可用相应指标来反映，如红白细胞数量、免疫细胞活性、酶活性指标等。因此血液是鱼类机体重要组成部分，更是机体免疫系统的重要组成［1］。

鱼类血液指标能反映机体生理状态和健康情况，检测血液指标，对于鱼病的预防和诊断、致病环境的评估与确定具有一定的指导意义［2-3］。该实验比较研究不同品种锦鲤血液细胞种类、形态大小、吞噬活性及酶活性等有关非特性免疫指标，了解机体适应能力，丰富鱼类比较免疫学知识和锦鲤血液生理基础知识，提供品种选择、种质优化、病害生态防控及渔药开发等理论依据，因此具有较高的研究及应用价值。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1锦鲤红白、黄金和大正三色锦鲤同一批次统一管理的当年鱼种，体质健壮、外表无伤、规格一致。

1.1.2抗凝血尾静脉采血，放于无菌离心管中，肝素钠溶液抗凝，4℃保存备用，当天测完。

1.1.3血清样尾静脉采血，室温放置凝固2 h，2 000 r/min离心10 min。取上清液-80℃保存备用。

1.1.4金黄葡萄球菌革兰阳性菌，由湖南省水产科学所病害室提供。

1.2实验方法

1.2.1血细胞计数［4］采用Neubauer（牛鲍）计数板，计数原则是数上线不数下线，数左线不数右线。每组重复4次。

红细胞计数：0.65%灭菌生理盐水稀释抗凝血液400倍再计数。

白细胞计数：白细胞稀释液稀释40倍，室温放置15 min，待红细胞溶解后再计数。

1.2.2血液涂片取抗凝血涂片，瑞士（Wright′s）染色，显微镜下观察并拍照。每组重复4次，随机测量200个红细胞的长短径。

1.2.3中性粒细胞吞噬功能［5］抗凝血液100 μL，加灭活105个细胞/mL金黄葡萄球菌50 μL，混匀，置湿盒内，放28℃恒温孵育30 min，间隔10 min摇匀一次。

取培养液涂片，瑞士染色，油镜观察，统计200个中性粒细胞吞噬细菌总数及参与吞噬的中性粒细胞数目，分别算出吞噬百分比和吞噬指数。

吞噬百分率（PP）=（吞噬细菌的细胞数/200个中性粒细胞）×100%

吞噬指数（PI）=（200个中性粒细胞吞噬细菌的总数/200个中性粒细胞）×100%

1.2.4硝基兰四氮唑（NBT）试验［5］凝血100 μL，加入等量NBT使用液，混匀，置湿盒内，放28℃恒温孵育25 min，期间摇匀2次。将上述培养液放置室温15 min，摇匀，取培养液涂片，瑞士染色，油镜观察，计算100个中性粒细胞中NBT细胞的个数。中性粒细胞质内有点状或块状蓝黑色甲簪颗粒的细胞为NBT阳性细胞。

1.2.5血液酶测定分析取不同锦鲤血清样品，按照试剂盒的操作步骤进行溶菌酶（LSZ）比浊法测定碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）及总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性检测。试剂盒购买于南京建成生物工程研究所。

按照自身对照法测定血清溶菌酶。溶菌酶活力（U/mL）=［（T样品-T样品0）/（T标准-T标准0）］×标准品浓度×样品稀释倍数；碱性磷酸酶（U/100 mL）：100 mL血清在37℃与基质作用15 min产生1 mg酚为1个金氏单位；酸性磷酸酶（U/100 mL）：100 mL血清在37℃与基质作用30 min产生1 mg酚为1个活力单位；总超氧化物歧化酶（U/mL）：每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位。

1.2.6数据处理用软件SPSS对实验数据进行统计和差异统计学意义分析（Compare Means Independent-Samples T-test），显著性检验水平为P＜0.5，所有数据以平均值±标准差表示。

2　结果

2.1锦鲤血细胞形态学特性比较

2.1.1血细胞种类与形态特征瑞士染色后的涂片，Olympus显微镜观察并拍照（图1）。三种锦鲤细胞种类相同，有红细胞、淋巴细胞、嗜碱性细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性细胞、单核细胞和血栓细胞，瑞士染色后，呈现不同颜色。

红细胞（Erythrocyte）：核紫红色，胞浆为橘红色，核为椭圆形（图1-1—1-3）；淋巴细胞（Lymphocyte）：胞浆为蓝灰色，核为紫红色，胞浆少，核几乎占住整个细胞（图1-4）；嗜碱性细胞（Basophil）：核颗粒紫红色或黑色圆形颗粒，胞浆呈蓝色，核椭圆形（图1-5）；嗜中性粒细胞（Neutrophil）：核颗粒紫色或紫红色，胞浆呈淡紫红色，核椭圆形（图1-6）；嗜酸性细胞（Eosinophil）：胞浆为红色或橘红色，核颗粒为红色，核椭圆形（图1-7）；单核细胞（Monocyte）：核偏于一侧或居中，核肾型，染色较疏松，胞浆蓝灰色，呈网状，常见空泡（图1-8）；血栓细胞（Thrombocyte）：白细胞一种，核呈杆状，呈紫红色，胞浆非常少，呈淡红色（图1-9）。在粒细胞中，细胞核多为椭圆形或肾形单核，很少见多核仁，核居中或偏位。

2.1.2血细胞数目与大小显微镜下统计红白细胞数目，血液涂片拍照，随机测量红细胞长、短径，计算长、短径比并进行显著性分析（表1）。

表1　红白细胞数目及红细胞长、短径比

3种锦鲤红细胞长短径比差异无统计学意义（P＞0.05），三色和黄金锦鲤红细胞数目差异不无统计学意义，明显少于红白锦鲤数目，差异极有统计学意义（P＜0.01），红白锦鲤白细胞数量最多，其次三色镜鲤和黄金，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2锦鲤血液生化特性比较

2.2.1中性粒细胞性能比较光学显微镜下观察统计不同锦鲤中性粒细胞的吞噬活性，进行显著性分析（见表2）和拍照（图1-10——图1-11），可明显看出锦鲤中性粒细胞均有不同程度的吞噬菌体，红细胞无吞噬或黏附功能（图1-12）。

中性粒细胞的吞噬百分比和NBT阳性百分比由高到低是红白锦鲤＞三色锦鲤＞黄金锦鲤，黄金锦鲤中性粒细胞吞噬指数高于其他2种锦鲤，差异有统计学意义。

2.2.2锦鲤血液酶活性比较检测不同锦鲤血清溶菌酶（LSZ）、碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）和总氧化物歧化酶（T-SOD）活性，实验数据见表3。三种鱼类的AKP、ACP和T-SOD活性差异无统计学意义（P＞0.05），黄金锦鲤LSZ活性高于三色和红白锦鲤，差异极有统计学意义（P＜0.01）。

3　讨论与分析

表2　中性粒细胞吞噬活性比较　%

表3　锦鲤血液酶活力比较

3.1红细胞

血液是鱼体内一种极为重要的组织，参与机体代谢、营养及免疫等过程，在一定程度反映着机体免疫水平，而红细胞是鱼类外周血细胞的主要组成，在机体内发挥着重要作用［6］。大量研究表明，鱼类红细胞具有携带与运输氧气的功能，个体越小，数量越多，携氧能力越强，而且还具有黏附或吞噬异物功能。王旭东［7］、冯守明［8］等发现大部分鱼类红细胞表面C3b受体能与酵母菌结合形成花环，或吞噬酵母，显示一定的免疫功能。该实验3种锦鲤红细胞长短径比差异无统计学意义，也就是红细胞个体大小差异不明显，而红细胞数量多的红白锦鲤，表明着其携带与运输氧气、机体呼吸机能也就强；在血液涂片和吞噬试验中均未见黏附、吞噬葡萄球菌，或NBT阳性红细胞，可能是实验锦鲤红细胞膜上没有黏附免疫复合物（IC），使葡萄球菌无法与IC 中IgGFc段相结合，无法清除葡萄球菌。

3.2中性粒细胞

吞噬主要由中性粒细胞，少量单核细胞完成，是一种比较重要的免疫途径和方式，是鱼类机体免疫功能的重要组成部分，能吞噬和消灭病原微生物的作用。中性粒细胞的吞噬百分比和NBT阳性率高低反映细胞吞噬与杀菌能力的强弱，结合白细胞数量的大小又反映出机体的非特异性免疫能力的高低［9］。实验中3种锦鲤吞噬百分比以红白锦鲤最高，其次是三色锦鲤和黄金锦鲤，都显示着较强的吞噬能力；实验锦鲤NBT阳性率均大于29%，根据学者沈玉清［5］研究，表示实验对象中性粒细胞吞噬功能正常，以红白锦鲤最高，同时也表明中性粒细胞在吞噬菌体过程中，还伴随呼吸爆发产生大量超氧阴离子和活性氧，能直接杀伤胞内菌体，清除异物，以红白锦鲤为之最；鱼体白细胞数量越多，鱼抗病能力越强［10］，而实验鱼白细胞数量依次红白锦鲤＞三色镜鲤＞黄金锦鲤，说明红白锦鲤更能适宜不良环境，显示出更强的抵抗力。从吞噬百分比、NBT%和白细胞数目变化趋势来看，均以红白锦鲤为最高，在一定程度上反映出其非特异性免疫能力较强。

3.3体液免疫因子

鱼类非特异性免疫防御体系清除异物过程中，不但有大量免疫细胞参与，而且还有许多高活性的免疫因子，其中AKP、ACP、T-SOD和LSZ的活性常被作为衡量机体免疫能力的参照指标。AKP、ACP等酶能参与消化、降解中性粒细胞吞噬的颗粒物，LSZ可直接溶解菌体，尤其革兰阳性菌，在机体免疫过程中起到极其重要的作用。3种实验锦鲤AKP、ACP、T-SOD活性差异无统计学意义，LSZ活性差异明显，以黄金锦鲤最高，极有统计学意义地大于红白锦鲤和三色锦鲤。这免疫因子的不同活性，可能显示着鱼类机体在处理革兰阳性菌非特异性免疫过程的不同，红白和三色锦鲤可能是先吞噬，后胞内杀菌为主，黄金锦鲤可能以高活性溶菌酶直接溶菌为主。

4　结论

结合血细胞数量、形态、功能与体液免疫因子，可得：在相同培育条件下，不同锦鲤机体非特异性免疫能力强弱有所不同，以红白锦鲤为最强，不同锦鲤机体处理革兰阳性菌的非特异性免疫过程也不尽相同。

［1］Zhou Yongcan，Xing Yuna，Feng Quanying.Reserch advance in haemocytes of fisher［J］.Journal of Hainan University: Natural Science Ed，2003（2）:171-176.

［2］Shigdar S，Cook D，Jones P，et al.Blood cells of Murray cod Maccullochella peelii（Mitchel）［J］.Journal of Fish Biology，2007，70（3）:973-980.

［3］Pavlidis M，Futter W C，Katharios P，et al.Blood cell profile of six Mediterranean mariculture fish species［J］.Journal of Applied Ichthyology，2007，23（1）:70-73.

［4］林浩然.鱼类生理学［M］.广州:广东高等教育出版社，1999，82-87.

［5］沈玉清，高德华.免疫学与血液检验学［M］.北京：中国医药科技出版社，1989：131-133.

［6］高泽霞，王卫民.鱼类外周血红细胞研究进展［J］.水利渔业，2008，28（2）:1-3.

［7］王旭东，绕家荣.红血细胞广泛吞噬作用的研究［J］.水产学报，1996，20（1）：72-75.

［8］冯守明，金万昆，李军，等.4种养殖鱼类非特异性免疫能力的比较研究［J］.水利渔业，2008，28（4）：58-59，62.

［9］聂品.鱼类非特异性免疫研究的新进展［J］.水产学报，1997，21（1）：69-73.

［10］卓孝磊，梁日深，梁桂洪，等.月鳢、乌鳢和斑鳢血液指标、血细胞比较分析［J］.科技导报，2008，26（13）：84-87.（收稿日期：2015-11-23）

Studied on the hematological indices of different Cyprinus carpio Koi

Wang Dongwu1，2，Deng Shiming1，Zou Li1，Li Shaoming1，2，Jiang Guomin1
（1.Fisheries Research Institute of Hunan Province，Changsha 410153，China；2，Hunan yuyuan Biological Technology Co.，Ltd.Changsha 410153，China）

The blood cell count，phagocytosis to Staphyloccocus aureus and enzyme activities of Cyprinus carpio Koi in the same environmental conditions were studied in the paper.The results showed that the counts of Kohaku'erythrocytes and leucocytes were the biggest among the experimental Cyprinus carpio Koi and the maximal rate of haemocytes phagocytosis to Staphyloccocus aureus and nitroblue tetrazolium（NBT）of Kohaku were （46.75±3.39）%and（61±5.66）%；the difference was not statistically significant among the acid phosphatase activities，alkaline phosphatase activities and total superoxide dismutase activities.So from the experimental result point of view，it was possible the nonspecific immunity ability of experimental fish and the process to deal withgram-positive bacteria were not equal，the cells of Kohaku and T﹒Sanke might phagocytose gram-positive bacteria and then kill them，but Yamabakiogon may kill gram-positive bacteria directly with lysozyme.

Cyprinus carpio Koi；hematological indices；comparative study