HPLC-MS/MS测定唾液中华法林浓度及其与血药浓度关系的探讨

王　政，李　哲，李　靖，杨春秀，张　健，沈　素，余俊先，王汝龙（.首都医科大学附属北京友谊医院药学部，北京 00050；.首都医科大学附属北京友谊医院医疗保健中心，北京 00050）



HPLC-MS/MS测定唾液中华法林浓度及其与血药浓度关系的探讨

王政1，李哲1，李靖2，杨春秀1，张健2，沈素1，余俊先1，王汝龙1（1.首都医科大学附属北京友谊医院药学部，
北京 100050；2.首都医科大学附属北京友谊医院医疗保健中心，北京 100050）

目的：建立唾液中华法林浓度的HPLC-MS/MS分析方法，并探讨其与血药浓度的关系。方法：采用HPLC法，色谱柱为SB-C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 µm），流动相为乙腈（A）/0.1％甲酸水溶液（B），流速0.4 mL·min-1，梯度洗脱；质谱采用ESI正离子模式。待测样本为服用华法林患者的唾液及血浆（均于服药后12 h采集）。结果：目标化合物华法林与内标BA-TPQ的离子质荷比（m/z）分别为309.1→163和278→91.1，二者洗脱分离完全，保留时间分别为1.828 min和1.566 min。华法林的提取回收率稳定，日内、日间精密度RSD ＜ 15％。待测样本的唾液华法林浓度为5.44 ng·mL-1，5.70 ng·mL-1和8.79 ng·mL-1，与其对应的血浆样品浓度为626.04 ng·mL-1、735.51 ng·mL-1、1 206.79 ng·mL-1。结论：本文建立的HPLC-MS/MS检测方法，可用于临床华法林的药物浓度监测，探索性的结果表明华法林的唾液浓度与血浆浓度的消除成平行关系，可考虑作为替代监测指标之一。

华法林；HPLC-MS/MS；唾液；血浆；血药浓度

华法林是目前应用最广泛的香豆素类口服抗凝药，通过抑制肝脏中依赖维生素K的凝血因子来发挥作用，用于预防和治疗深静脉血栓、肺栓塞、心脏瓣膜置换术及心房颤动导致的血栓形成，降低心肌梗死复发及心肌梗死后血栓栓塞死亡的危险性［1-2］。华法林的治疗窗窄、个体差异大，影响因素多，遗传变异和种族差异是剂量个体化的最主要原因［3-4］。华法林抗凝疗效与患者术后出血或栓塞并发症、远期生存质量及生存率密切相关［5］，因此服药患者的抗凝监测十分重要，监测不当可导致出血或栓塞等并发症， 严重者可危及患者生命［6］。

国际标准化比值（INR）法因校正了试剂敏感性的差异，使测定结果能相对较准确地反映抗凝强度，在临床上广泛使用。寻求一种无创、快捷、简便、灵敏、准确的分析方法和简便的样品采集装置已日渐引起研究者的关注，唾液为非创伤性采集的体液样本，采集方便，且可避免因抽血带来的身体不适、晕血及感染等［7］。为此我们参考已有的关于华法林血浆药物浓度的测定方法［8］，尝试建立唾液中华法林浓度测定方法学，以期为其临床药物监测提供参考。

1　材料与方法

1.1药品和试剂

华法林（分析纯，纯度97.2％，批号45706-250MG-R， Sigma-Aldrich公司）；内标物：BA-TPQ（纯度98％）［8］；乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，乙酸乙酯为分析纯，其他试剂均为市售分析纯。

1.2仪器和分析参数

1.2.1主要仪器 HPLC-MS/MS系统，包括1200液相色谱（二元泵、脱气机、自动进样器、柱温箱等）和6460三重四级杆质谱（美国Agilent公司）；BS 124S分析天平（德国Sartorius公司）；MS-3涡旋器（德国IKA公司）；Sigma 3-18K低温离心机（德国Sartorius公司）。

1.2.2HPLC-MS/MS参数设置 色谱柱为SB-C18柱（2.1 mm × 50 mm，1.8 μm，美国Agilent公司）；流动相：乙腈（A）-0.1％甲酸水溶液（B）；梯度洗脱：0 ～ 1 min 50％ A，1 ～ 2 min 90％ A，2 ～ 3 min 50％ A；流速：0.4 mL·min-1；柱温：40 ℃。离子源为电喷雾离子源ESI，正离子模式；毛细管电压5 kV；干燥气流速8 L·min-1；干燥气温度350 ℃；雾化气压力30 psi；碎裂电压50 V，详见表1。选择的检测离子质荷比（m/z）：华法林：309.1→163；BA-TPQ：278→91.1。

表1　华法林和内标的HPLC-MS/MS参数Tab 1　HPLC-MS/MS parameters of warfarin and IS

1.3方法学考察

1.3.1工作液、标准曲线及质控样品的配制 工作液：精密称取华法林10 mg和内标BA-TPQ 5 mg，以甲醇为溶剂配制成1 mg·mL-1的储备液及1 μg·mL-1的内标液。以甲醇为溶媒，将储备液分别稀释成50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、250 ng·mL-1、500 ng·mL-1、2.5 μg·mL-1、5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、30 μg·mL-1的工作液。取工作液5 μL，分别用空白唾液和空白血浆稀释配制标准曲线，唾液L1-L8为1、2、5、10、50、100、200、600 ng·mL-1，低、中、高三个质控样品的浓度为2、40、500 ng·mL-1，血浆的L1-L8为10、20、50、100、200、500、1000、3000 ng·mL-1。

1.3.2样品的预处理 取含药唾液500 μL，加入5 μL内标液以及500 μL乙酸乙酯，涡旋60 s使样品充分混匀，低温离心机在4℃的条件下高速离心20 min （18 000 g），上层有机相用氮气吹干，用100 μL流动相复溶，取2 μL进样HPLC-MS/MS分析。取含药血浆50 μL，加入5 μL内标液以及500 μL乙酸乙酯，其余步骤同上，氮气吹干后以100 μL流动相复溶，取2 μL定量分析。

1.3.3回收率、准确度、精密度和基质效应 取浓度为2、40、500 ng·mL-1的质控样品，每个浓度平行处理3份，预处理方法同“1.3.2”项下操作，考察提取回收率。每个浓度平行处理5份，考察日内和日间精密度。用流动相配制低、中、高3个浓度样品，加入内标，测得响应值A；在空白唾液提取后加入相同质控和内标，测响应值B，基质效应ME％ = 响应值B/响应值A×100％。

1.3.4稳定性考察 三个浓度的质控样品按“1.3.2”项下方法预处理，考察进样器中放置24 h的稳定性，以及样品经3次冻融循环于室温放置24 h和低温（- 20 ℃）储存2周的稳定性。

1.4受试者样品检测

临床试验经北京友谊医院伦理委员会批准。纳入3例冠心病患者，2男1女，年龄75 ～ 81岁，华法林服药方法均为3 mg，qd。服药后12 h采取唾液2.0 mL，同时取静脉血2.0 mL置于EDTA离心管中，3000 r·min-1，离心10 min，分离血浆备用。唾液和血浆样品按“1.3.2”项下方法预处理，分别测定唾液和血浆中华法林的浓度。

2　结果

2.1方法学专属性

在上述条件下进行检测，华法林和BA-TPQ的保留时间分别为1.828 min和1.566 min，空白唾液和血液中内源性物质无干扰，具有较好的专属性。详见图1。

2.2线性范围、回收率和基质效应

唾液中华法林浓度在1 ～ 600 ng·mL-1范围内线性关系良好，线性方程为y = 15.713 1 x + 0.001 9（r = 0.999 7）。空白血浆中华法林浓度在10 ～ 3000 ng·mL-1范围内线性关系良好，线性方程为y = 0.876 x + 0.017 8 （r = 0.994 2）。相对标准偏差RSD可评估回收率及基质效应。结果表明华法林在唾液中的回收率稳定在83.19％ ～ 102.29％，RSD在±15％以内。基质效应在83.41％ ～ 102.71％，RSD在±15％以内，对MS信号不产生干扰。

图1　HPLC-MS/MS色谱图A - 空白唾液，B - 空白唾液+华法林（200 ng·mL-1），C - 空白唾液+华法林（200 ng·mL-1） +内标物BA-TPQ（ 1 μg·mL-1），D - 受试者唾液样品；1 - 华法林，2 - 内标（BA-TPQ）Fig 1　Chromatograms of HPLC-MS/MS A - blank saliva， B - blank saliva + warfarin （200 ng·mL-1）， C - blank saliva + warfarin （200 ng·mL-1） + BA-TPQ （1 μg·mL-1）， D - saliva sample of patient； 1 - warfarin， 2 - internal standard（ BA-TPQ）

2.3准确度和精密度考察

对高中低三种浓度的质控样本在连续3 d内进行准确度和精密度的验证（n = 5，3，3）。RSD可用于评估精密度，准确度是实际浓度平均值与理论浓度的比值，准确度和精密度需要保持在±15％，详见表2。

表2　精密度、回收率和基质效应Tab 2　The precision， recovery and matrix effect

2.4稳定性

反复冻融稳定性和短期稳定性实验结果表明，华法林在反复冻融的条件下以及在进样器中放置24 h稳定，详见表3。

2.5受试者唾液及血液中华法林浓度测定

收集3例长期服用华法林患者（编号Sample A、 Sample B、Sample C）唾液及血液，按“1.3.2”项下方法处理样品并检测浓度。结果如下，3例患者唾液中华法林浓度分别为5.44、5.70、8.79 ng·mL-1，与其对应的血液中华法林浓度分别为626.04、735.51、1 206.79 ng·mL-1。将唾液中华法林浓度与其血药浓度进行对比，结果详见图2。

表3　稳定性实验结果Tab 3　The results of stability tests

图2　受试者唾液和血浆中华法林的浓度分布Fig 2　Distribution of warfarin concentration in patients' saliva and plasma

3　讨论

3.1INR监测的特点

华法林临床应用特点是治疗窗窄、不良反应严重、个体差异大，因此服药患者的抗凝监测十分重要。许多服用华法林的患者年龄较大，更有脑梗后偏瘫卧床者，定期到医院抽血监测INR及血药浓度对患者而言较为麻烦。然而，未按指南推荐时间测定INR有可能导致抗凝强度不足或发生出血等不良反应［9］。因此，本课题组利用唾液这个取材简便且又无创的体液，借助HPLC-MS/MS等多种大型仪器建立新的方法学，以期为治疗药物监测提供新思路。

3.2唾液中华法林浓度测定的可行性

本研究结果显示，唾液中华法林在1 ～ 600 ng·mL-1浓度范围内线性关系良好，r = 0.999 7，且日间精密度、日内精密度及冻融稳定性均符合要求，故本实验方法学准确、可靠、稳定。我们测定所收集的三个样本，将华法林在患者唾液中的浓度和血浆中的浓度进行对比，二者具有相关性，与预测结果相符合。即血浆中华法林浓度较高者其唾液中含药量也较高，这为日后建立成熟的唾液法监测华法林浓度提供了理论基础。

本次试验在方法学设计上主要有以下几点优势：1）采用乙酸乙酯液-液萃取法除蛋白，与蛋白沉淀法相比更为彻底［9］，使基质对测试的影响更小；2）采用梯度洗脱可保证在前1分钟内洗脱出大量生物样本中的水溶性杂质，又可在尽可能短的时间内（4 min）完成全部洗脱，节省试验时间；3）质谱条件调试合理，既有较高分离度，又满足了唾液中微量华法林的测定要求，定量下限（LLOQ）可达到1 ng·mL-1，并可保证其准确度，为此次试验提供了良好的灵敏性。

3.3唾液中华法林浓度测定的局限性

唾液中药物检测受到采集技术与方法、药物特性、给药途径、个体差异（年龄、机体生理疾病、情绪状态）等因素的影响较大［10-12］，因此仍需逐步建立唾液采集标准方法和检测标准。在未来的治疗药物监测中，唾液所具有的采集方便、操作简单的突出优势必将使其受到更多的重视，检测技术日臻得到完善，最终更好地为临床服务。

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Quantitative determination of warfarin in human saliva and plasma by HPLC-MS/MS and the analysis of their correlation

WANG Zheng1， LI Zhe1， LI Jing2， YANG Chun-xiu1， ZHANG Jian2， SHEN Su1， YU Jun-xian1， WANG Ru-long1
（1. Department of Pharmacy， Beijing Friendship Hospital， Capital Medical University， Beijing 100050， China； 2. Medical and Health Center， Beijing Friendship Hospital， Capital Medical University， Beijing 100050， China）

Objective： To determine the concentration of warfarin in human saliva and plasma by HPLC-MS/MS， and the correlation between saliva and plasma warfarin concentration was discussed. Methods： The separation was performed on a SB-C18column with an gradient mobile phase consisting of acetonitrile （A） / 0.1％ formic acid aqueous solution （B） at the fow rate of 0.4 mL·min-1. Detection was carried out on a mass spectrometer by positive electrospray ionization （ESI） in multiple reaction monitoring （MRM） mode. All samples were collected 12 h after warfarin therapy. Results： Warfarin and the internal standard （IS） were detected at m/z 309.1→163 and 278→91.1， respectively. Two compounds were eluted completely and their retention time were 1.828 min and 1.566 min， respectively. The intra-day and inter-day precision relative standard deviations （RSD） were less than 15％. The warfarin concentrations in saliva samples were 5.44 ng·mL-1， 5.70 ng·mL-1and 8.79 ng·mL-1， respectively. Meanwhile， the warfarin concentration in plasma were 626.04 ng·mL-1， 735.51 ng·mL-1and 1 206.79 ng·mL-1. Conclusion： The HPLC-MS/MS method can be applied to the concentration monitoring about warfarin. There is a correlation between warfarin concentration in saliva and plasma， and the warfarin concentration in saliva can be potentially considered as monitoring surrogate marker.

Warfarin； HPLC-MS/MS； Saliva； Plasma； Blood drug concentration

R917

A

1672 - 8157（2016）03 - 0144 - 04

余俊先，男，副主任药师，主要从事临床药学工作。E-mail：junxianyu@ccmu.edu.cn

王政，女，在读硕士研究生，研究方向：临床药学。E-mail：zhengwangccmu@hotmail.com

（2015-11-15

2016-02-01）