江西省C群脑膜炎奈瑟菌药物敏感性及PFGE分子特征分析

熊长辉，杨　梦，刘晓青，徐晓倩，王　鹏，袁　辉



江西省C群脑膜炎奈瑟菌药物敏感性及PFGE分子特征分析

熊长辉，杨梦，刘晓青，徐晓倩，王鹏，袁辉

目的分析江西省2006-2010年分离的C群脑膜炎奈瑟菌的药物敏感性及分子特征。方法采用E-test试纸条检测方法对38株C群脑膜炎奈瑟菌菌株进行体外抗菌药物敏感性检测，利用脉冲场凝胶电泳技术(Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE)进行分子特征分析。结果所有菌株对氯霉素、美洛培南、阿奇霉素、米洛环素、头孢噻肟、头孢曲松和利福平均敏感；15(39.5%)株菌株对青霉素不敏感，18(47.4%)株对氨苄西林不敏感，25(65.8%)株对环丙沙星耐药，23(60.5%)株对左氧氟沙星耐药，11(28.9%)株对复方新诺明不敏感。PFGE分型显示以AH1和AH2型为主，并且同一地区的带型以同一种带型为主。结论江西省2006-2010年分离C群脑膜炎奈瑟菌株对喹诺酮类药物具有较高的耐药性，还有大部分菌对磺胺类和青霉素类药物也不敏感。PFGE分型特征虽然呈多态性，但是以AH1和AH2型为优势克隆型。

脑膜炎奈瑟菌；分子分型；药敏试验；脉冲场凝胶电泳

脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis，Nm) 是引起细菌性脑膜炎的主要病原菌，及时诊断和抗菌药物的干预对临床治疗起到至关重要的作用。由于Nm菌株的分子型别和耐药性在不断发生变化，因此，对Nm菌株进行分子特征分析以及抗生素耐药性检测和监测，及时了解Nm菌株和耐药性的变迁情况，为临床治疗用药和预防性服药提供实验室依据尤为重要。本研究对江西省2006-2010年分离的38株C群脑膜炎奈瑟菌进行了抗生素体外敏感性实验和PFGE分子分型，以观察C群Nm耐药性和分子特征的变化趋势。

1　材料与方法

1.1菌株来源

1.1.1实验菌株江西省2006-2010年从病人、密切接触者和健康人群分离C群脑膜炎奈瑟菌菌株38株。

1.1.2参考菌株药敏质控菌株为S.pneumoniaeATCC 49619 菌株和PFGE的DNA分子量标准参考菌株H9812均由中国疾病预防控制中心提供。

1.2主要试剂及耗材E-test 试纸条(bioMerieux SA)、培养基为加5%羊血的Mueller-Hinton(M-H) 琼脂、NheI和XbaI内切酶(TaKaRa)，一次性Falcon 2054试管(BD公司)，一次性50 mL screw-cap tube(BD公司)， SeaKem Gold Agarose(瑞士Lonza公司)。

1.3主要仪器微量高速离心机(eppendorf)、自动凝胶成像仪(Bio-Rad)、脉冲场凝胶电泳系统 CHEF MAPPER(Bio-Rad)，细菌浊度仪(bioMerieux)，超净工作台(中国苏净安泰SW-CJ-2FD)、 二氧化碳培养箱(UNAIRE)、高速冷冻离心机(SIGMA 3-18K)、生物安全柜(Thermo)。

1.4方法

1.4.1药敏试验用无菌棉拭子刮取分纯后的待测菌于无菌的M-H稀释肉汤(用前加热到35 ℃) 制成0.5麦氏单位的菌悬液，然后均匀涂布于含5%羊血的M-H琼脂平板上，粘贴E-test药敏试纸条，置于二氧化碳培养箱中，37 ℃培养18～22 h。用质控菌株S.pneumoniaeATCC 49619做同步试验，根据最新版美国临床和实验室标准委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推荐的抗微生物药物敏感性试验执行标准进行结果判定。

1.4.2PFGE

1.4.2.1PFGE实验参考中国疾病预防控制中心PulseNet China 网络实验室推荐的脑膜炎奈瑟菌PFGE标准操作方法对分离的38株脑膜炎奈瑟菌进行PFGE分型。实验菌株选用NheI限制性内切酶酶切,200 μL 体系,酶切3 h。Marker沙门菌H9812标准菌株选择XbaⅠ限制性内切酶酶切,其余参数与受试菌株相同。电泳条件： initial pulse：1 s； final pulse： 25 s；电压：6 V/cm；电泳时间：16 h；温度：14 ℃。电泳结束后，将胶块放入1 μg/mL的EB液中染色30 min，清水脱色1 h后，凝胶成像系统Gel Doc XR下观察结果。

1.4.2.2聚类分析PFGE图像导入Bio Numerics(version 6.0,Applied Maths,Inc)软件包进行处理，选择Dice相关系数和UPGMA方法，条带位置差异容许度tolerance设置为1.5%。

2　结　果

2.1药敏试验15(39.5%)株菌对青霉素不敏感，18(47.4%)株菌对氨苄西林不敏感，25(65.8%)株菌对环丙沙星耐药，23(60.5%)株菌对左氧氟沙星耐药，11(28.9%)株菌对复方新诺明不敏感，所有菌株对美罗培南、氯霉素、阿奇霉素、利福平、米诺环素、头孢噻肟、头孢曲松7种药物均敏感，敏感率为100.00%。

2.2PFGE

2.2.1PFGE分型38株C群脑膜炎奈瑟菌菌株用NheI 限制性内切酶酶切后进行脉冲场凝胶电泳，可得到大小从20～1 200 kb的电泳片段，不同的菌株条带数从4～12条不等。部分C群脑膜炎奈瑟菌菌株PFGE酶切指纹图谱(见图1)。

M: Salmonella reference strain H9812, lane2-14 serogroup C Neisseria meningitidis strains.图1　C群脑膜炎奈瑟菌PFGE酶切电泳图谱(Nhe I限制性内切酶)Fig.1　PFGE profile of serotype serogroup C Neisseria meningitidis strains digested with Nhe I

2.2.2聚类分析对38株C群脑膜炎奈瑟菌菌株的PFGE结果用Bio Numerics软件进行聚类分析，按照100%的相似度，38株C群脑膜炎奈瑟菌菌株可分为5个不同的PFGE型别，不同菌株的相似系数在52.1%～100%之间，命名参照中国疾病预防控制中心传染病预防控制所呼吸道传染病室的命名方式命名，38株菌株PFGE型别分别为AH1型13株，AH2型22株， AH44型、AH45型、AH46型个1株，如图2。

图2　江西省C群Nm菌株PFGE聚类分析Fig.2　Cluster analysis of serogeuop C strains by PFGE in Jiangxi Province

3　讨　论

抗生素在控制各种细菌性感染、防治传染病、降低病死率方面发挥了十分重要的作用，成为目前临床使用最多的药物。但是，随着抗生素的广泛应用，Nm 菌株的耐药现象逐渐凸显出来，由于Nm菌群结构的改变[1-2]，其耐药的模式也越来越复杂。因此，对Nm菌株进行抗生素耐药性检测和监测以及菌群分型，为流脑的临床治疗用药和预防性服药提供实验室的重要依据是非常有必要的。由于脑膜炎奈瑟氏菌的PFGE分析已经被接受为 PulseNet 一种必不可少的部分[3]。所以本研究根据PulseNet China标准试验方案和临床实验室标准化研究所(CLSI) 推荐标准[4]，采用E-test 浓度梯度扩散法，对我省近几年的流脑患者及健康携带者分离的38株Nm 菌株，进行了抗生素体外敏感性实验和PFGE分子分型，以观察我省近年C群Nm菌株耐药谱的变化趋势以及耐药菌株PFGE分子分型的特点。

我国其他地区的Nm 菌株的药敏监测结果显示[5]，对青霉素类不敏感的菌株也在逐渐增多，虽然对青霉素的敏感性已经降低，但未出现耐药菌株，而本次研究我省38株Nm 菌株有8株对青霉素耐药，耐药率达21.1%，PFGE分子分型主要是AH2型, 对氨苄西林不敏感的有18株，占47.4%，PFGE分子分型同样是AH2型菌株。我国Nm 菌株的环丙沙星耐药率明显高于其他国家，分子分型和相关基因测序结果显示，高的耐药率与我国流行的克隆群紧密相关[6-10]。本次研究有25株Nm 菌株对环丙沙星耐药，耐药率达65.8%，PFGE分子分型为AH2型15株，AH1型8株，AH45、AH46各1株。同时23株Nm 菌株对左氧氟沙星耐药，耐药率为60.5%，PFGE分子分型为AH2型17株，AH1型5株，AH45 1株。虽然喹诺酮类药物并不是临床首选的治疗流脑用药，但这可能与临床上广泛用喹诺酮类药物治疗其他感染有关。本研究发现28.9%的菌株对复方新诺明不敏感，主要菌型为AH2型。38株Nm 菌株对美罗培南、氯霉素、阿奇霉素、利福平、米诺环素、头孢噻肟、头孢曲松7种药物的敏感率均为100.00%，这与我国其他地区分离菌株一致[11-12]。根据PFGE分型图谱和药敏结果分析显示江西省2006-2010年分离到的C群Nm菌株对抗生素耐药和不敏感主要以AH2型为主。对菌株耐药和不敏感的抗生素主要是青霉素类、喹诺酮类和磺胺类药物，所以在流脑治疗和预防中对青霉素、喹诺酮类和磺胺类药物应谨慎使用。

从本研究中的PFGE酶切图谱和聚类分析可以发现江西省C群Nm菌株主要为AH1和AH2型，这和我国C群流脑流行的主要型别一致。根据流行病学资料显示江西省2006-2010年在同一地区分离的C群Nm菌株PFGE酶切图谱带型较为一致，同一地区同一带型在不同年份能够连续出现，不同地区分离菌株间相似性系数从52.1%～100%不等，并且病人分离菌株与其密切接触者分离菌株带型相似度达100%。根据本研究显示我省近年分离到的C群Nm菌株分子分型特点虽然呈现多态性，但是以AH1和AH2型为优势克隆型，同一地区优势克隆型较为一致，不同地区优势克隆型不同，但随着不同地区的交往和人口流动可能会引起不同地区不同菌型的交叉传播，应引起重视。

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Drug susceptibility testing and PFGE typing ofNeisseriameningitidesserogroup C strains isolated in Jiangxi Province, China

XIONG Chang-hui, YANG Meng, LIU Xiao-qin, XU Xiao-qian, WANG Peng, YUAN Hui

(JiangxiProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanchang330029,China)

The study was conducted to evaluate the altering patterns of antibacterial drug sensitivity and PFGE typing ofNeisseriameningitidisserogroup C strains isolated in Jiangxi Province. Isolates were subjected to a drug susceptibility test using the E-test method and Pulsed-Field Gel Electrophoresis was used to characteristics of molecules. All of the 38 strains were sensitive to chloramphenicol, meropenem, azithromycin, minocycline, cefotaxime, ceftriaxone and rifampicin; 15(39.5%) strains were not sensitive to penicillin, 18(47.4%) strains were not sensitive to ampicillin and 11 (28.9%) were not sensitive to trimethoprim sulfamethoxazole; 25(65.8%) strains were resistant to ciprofloxacin and 23(60.5%) strains were resistant to levofloxacin; PFGE belt type prompt AH1 and AH2 type in the majority. TheNeisseriameningitidisserogroup C strains were highly resistant to quinolones, while showed lower resistance to sulfonamides and penicillin isolated in Jiangxi Province. AH1 and AH2 is the main type with the gene polymorphism analysis.

Neisseriameningitidis; molecular typing; drug susceptibility test; PFGE

Supported by the Science and Technology Program of Health and Family Planning Commission of Jiangxi Province (No. 20156029)

Yuan Hui, Email: jxcdcyuanhui@126.com

袁辉， Email：jxcdcyuanhui@126.com

江西省疾病预防控制中心传染病所，南昌330029

R378.1

C

1002-2694(2016)07-0679-04

2016-02-23;

2016-06-21

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.018

江西省卫生计生委科技计划(No.20156029)