2015年春季无锡地区儿童肺炎支原体及呼吸道常见致病菌的分析

常　青，闫　超，俞　蓉，高燕敏，欧阳冰，孙红妹



2015年春季无锡地区儿童肺炎支原体及呼吸道常见致病菌的分析

常青1，闫超2，俞蓉1，高燕敏1，欧阳冰1，孙红妹2

目的了解无锡地区下呼吸道感染住院患儿肺炎支原体耐药情况及呼吸道常见致病菌的分布，为预防和治疗提供依据。方法采用PCR法检测患儿咽拭子中的肺炎支原体及其耐药基因，采用real-time PCR法检测其他呼吸道常见致病菌。结果共检测标本288例，检出病原菌59例，阳性检测率为20.5%。细菌检出率随年龄增长有下降趋势，<2岁儿童阳性检出率最高，且女性高于男性。病原菌构成比分别为：肺炎支原体28.8%(17/59)，KP为30.5%(18/59)，SA为20.3%(12/59)，PA为20.3%(12/59)，SE为15.3%(9/59)，HI为10.2%(6/59)，SP为5.08%(3/59)，LP为5.08%(3/59)，EC，CP，TB均为0例(0%)。其中肺炎支原体大环内酯类耐药率为88.2%，10例存在合并感染。结论无锡地区住院患儿下呼吸道感染的病原菌以肺炎支原体和肺炎克雷伯杆菌为主，且大环内酯类耐药率较高。

肺炎支原体；耐药；呼吸道常见病原菌；儿童；无锡

Supported by the Wuxi Municipal Commission of Health and Family Planning (Woman and Child Health Scientific Research Project)

呼吸道感染是儿童最常见的疾病，可引起儿童急性支气管炎、肺炎，严重者可引起呼吸衰竭和心力衰竭，对患儿的危害较大。据联合国儿童基金会统计，全世界每年约有350万左右5岁儿童死于肺炎；我国每年<5岁儿童因肺炎死亡者约35万人[1]。其中，肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae, MP)是引起儿童呼吸道感染的重要致病菌之一，临床症状可从轻微的咽炎、支气管炎到重症肺炎，严重感染可导致死亡[2]。MP引起的肺炎，占社区获得性肺炎的20%左右，流行高峰年其感染率可达30%以上[3]。此外，儿童呼吸道常见病原菌主要包括肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae，SP)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae，KP)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, SA)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis，SE)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae，HI)、大肠埃希菌(Escherichiacoli，E.coli，EC)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)、结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，TB)、肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae，CP)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila，LP)等[4]。此前，关于无锡地区呼吸道感染的相关报道较多，但关于肺炎支原体与呼吸道感染及其他常见致病菌关系以及肺炎支原体耐药分析方面的报道较少。

本研究收集下呼吸道感染住院患儿标本，进行肺炎支原体及其他呼吸道常见致病菌检测，了解呼吸道感染中肺炎支原体与其他常见病原菌的构成关系，以及肺炎支原体耐药情况，对无锡地区2015年春季儿童呼吸道感染现状进行分析。

1　材料和方法

1.1研究对象与标本采集2015年2-5月，无锡市第八人民医院儿科住院下呼吸道感染的患儿标本288例，来自无锡市各区，下呼吸道感染诊断标准参照《诸福棠实用儿科学》第7版，排除标准：支气管肺发育不良，先天性心脏病，免疫缺陷病等。标本类型为咽拭子(用无菌咽拭子，在被检测患儿咽后壁采集分泌物)。其中，2015年2月127例(44.1%)，3月35例(12.2%)，4月55例(19.1%)，5月71例(24.7%)；男166例(57.6%)，女122例(42.4%)；年龄为7月～13岁，平均年龄为3岁9月。其中<1岁28例(9.72%)，1～2岁82例(28.5%)，3～6岁144例(50.0%)，7～13岁34例(11.8%)。

1.2研究方法

1.2.1标本DNA提取采用Qiagen 的QIAamp DNA提取试剂盒对上述呼吸道标本进行DNA提取，操作步骤严格按照说明书进行。DNA提取后保存于-20 ℃用于呼吸道常见病原菌检测。

1.2.2肺炎支原体检测采用首都儿科研究所细菌研究室设计的引物[5]，针对肺炎支原体的基因组中的串联重复序列区域Mpn14进行扩增，片段长度为243 bp。25 μL PCR反应体系中包含2× Taq PCR MasterMix (天根生化科技北京有限公司)12.5 μL，5 μL模板DNA，上、下游引物浓度均为0.4 μmol/L。PCR反应条件为：95 ℃预变性10 min, 95 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min扩增35个循环, 72 ℃再延伸 10 min。在Veriti 96-well 热扩增仪(Applied Biosystems，美国)上进行扩增。PCR产物通过琼脂糖凝胶观察结果。阳性扩增产物由invitrogen 英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，并利用Basic Local Alignment Search Tool analysis (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对。

1.2.3肺炎支原体耐药基因检测采用李少丽等文献中报道的nPCR-SSCP-CE法，结合套式PCR、单链构象多态性分析(SSCP)和毛细管电泳(CE)的方法，分析Mp 23S rRNAV区中常见的耐药基因突变位点2063和2064[6]。存在突变的扩增产物由invitrogen 英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，并将测序结果利用Blast进行比对，进一步验证常见耐药突变位点是否发生突变。

1.2.4其他呼吸道常见致病菌检测参照首都儿科研究所细菌研究室设计的引物，扩增Sp，Kp，Sa，Se及Hi[7]，此外利用primer5.0软件设计特异性引物扩增Cp，Lp，Tb，Pa，Ec。用DNA分析软件(http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp)评价引物之间有无二聚体及环状结构，同时在NCBI数据库中(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)进行Blast比对，检测引物特异性。引物由上海英骏生物技术有限公司合成，引物序列及扩增片度长度见表1。采用real-time PCR(SYBR Green I)法，扩增目的片段。20 μL PCR反应体系中包含2× SuperReal PreMix Plus with SYBR Green I(天根生化科技北京有限公司)10 μL，5 μL模板DNA，上、下游引物浓度均为0.25 μmol/L。PCR反应条件为：95 ℃预变性8 min, 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s，扩增35个循环。

1.2.5统计学方法应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，分析过程中应用了卡方检验，两两比较过程中采用配对设计四格表卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1肺炎支原体检测结果288例下呼吸道感染标本中，17例为肺炎支原体阳性，阳性率为5.90%。其中2月7例，3月4例，4月5例，5月1例，阳性率分别为5.51%，11.4%，9.09%和1.41%。其中男性中检测出MP阳性6份，女性中检测出MP阳性11份。MP阳性标本在不同年龄组的分布为，<1岁为2例，1～2岁为3例，3～6岁为9例，7～13岁为3例，各年龄组的阳性率分布为7.14%，3.66%，6.25%和8.82%。采集时间，患儿性别及年龄的差异均无统计学意义。

表15种呼吸道常见致病菌检测引物

Tab.1The primer sequences used for the bacteria detection

PrimersGeneSequence(5'-3')Length(bp)CP16SrRNACP-F1346TCCCCTTCTTTAATATATATTAG1368139CP-R1486TGACTTCGGTTGTTATTTAGTGGCG1460LP16SrRNALP-F808TTGGTTATATGAAAATAATTA82895LP-R902CCGTCAATTCATTTGAGTTT883TB16SrRNATB-F672GGTGTAGCGGTGGAATGCGC691140TB-R811CACCGTTTACGGCGTGGAC793PA16SrRNAPA-F1381GGGCCTTGTACACACCG1397128PA-R1508ACGGTTACCTTGTTACGACTT1488EC16SrRNAEC-F49TAACACATGCAAGTCG6471EC-R119TTACTCACCCGTCCGCC103

2.2肺炎支原体耐药基因检测结果17例肺炎支原体阳性标本中，15例存在大环内酯类耐药基因突变，突变率为88.2%，其中14例为A2063G突变，1例为A2063T的突变。

2.3呼吸道常见致病菌检测结果除MP外，288例标本中54例(18.8%)可检测出其它呼吸道常见致病菌，构成比分别为：KP为30.5%(18/59)，SA为20.3%(12/59)，PA为20.3%(12/59)，SE为15.3%(9/59)，HI为10.2%(6/59)，SP为5.08%(3/59)，LP为5.08%(3/59)，EC，CP，TB均为0例(0%)， KP，SA以及PA感染占主要地位。2月18例，3月18例，4月12例，5月6例，阳性率分别为14.2%，51.4%，21.8%和8.45%。各月份细菌感染比较，差异有统计学意义(χ2=31.5，P<0.05)，3月份明显高于其他月份。存在细菌感染的男性为18例，女性为36例，阳性率分别为10.8%和29.5%，差异有统计学意义(χ2=16.1，P<0.05)，女性高于男性。细菌感染在不同年龄组的分布为，<1岁为12例，1～2岁为15例，3～6岁为24例，7～13岁为3例，各年龄组的阳性率分布为42.6%，18.3%，16.7%和8.82%，差异有统计学意义(χ2=13.3，P<0.05)，其中<1岁组高于其他年龄组。54例细菌感染标本中，6例(11.1%)存在合并感染，其中KP+PA为3例，SA+HI+PA为3例。与MP感染综合分析可知，肺炎支原体与细菌感染标本共59例，阳性率为20.5%。其中，10例(10/59，16.9%)存在合并感染的标本中，除SA+HI+PA及KP+PA(均为3例)外，MP+KP为2例，MP+HI为1例，MP+PA为1例。2月3例，3月1例，4月2例，5月4例；男性中检测出2例，女性中检测出8例；在不同年龄组的分布为，<1岁为4例，1～2岁为0例，3～6岁为3例，7～13岁为3例，差异均无统计学意义(所有P值均>0.05)。

表2288例标本合并感染情况

Tab.2Co-infection in the 288 specimens

Co-infectionTypesNumberTwoKP+PA3Mp+KP2Mp+HI1Mp+PA1ThreeSA+HI+PA3

3　讨　论

肺炎支原体是社区获得性呼吸道感染的重要致病菌之一，尤其是学龄前儿童和青壮年。儿童肺炎中10%～30%的病例是MP引起的，一年四季均有出现，但以冬春季发病为主。主要通过与患者的近距离接触传播，从接触密切的亲属和社区开始流行，每3～7年在不同地区出现MP流行高峰，在流行高峰年MP肺炎可高达30%～50%[2-3]。对家庭、学校、部队、社会都会产生较大的经济损失和社会不良影响，应该引起人们足够的重视。研究资料显示，无锡地区肺炎支原体感染率2004-2005年为27.0%[8]，2007年为27.11%，MP的感染率相对较高[9]。本研究中，MP的阳性检测率为5.90%，低于项红霞等报道的无锡地区2008-2010年感染率[10]。我们之前的研究显示[11]，2007年和2012年为MP的暴发流行年，而2015年2-5月为非流行期，因此，MP感染率相对较低。

2000年以来，世界各地均陆续出现了肺炎支原体耐药的相关报道。大环内酯类耐药基因检出率不断攀升，欧洲国家的耐药率较低，小于10%[12]，美国也低于10%[13]，而日本耐药率大于80%[14]，在中国耐药率最高，达到了90%以上[15]，但关于无锡地区肺炎支原体临床菌株耐药性报道较少。本研究中，肺炎支原体大环内酯类耐药基因突变率为88.2%，与北京，上海等地区的报道一致[15-16]，远远高于欧美国家[12-13]，在肺炎支原体治疗用药方面应该引起足够重视。

病毒是上呼吸道感染的主要病原，细菌是下呼吸道感染的主要病原，细菌感染率可高达55%。病原菌的分布特点与时间和地域差异关系密切，了解细菌分布，对于临床诊断和治疗均有重要意义，可避免抗生素的滥用和耐药菌株的产生。目前，病原菌分离培养法为病原学诊断的金标准，也是目前临床最常用的诊断方法，但分离培养耗时长，受标本采集、运输和培养条件的影响较大，且有些需特殊培养的常见细菌如SP、HI 的检出率不高。

本研究中，下呼吸道感染患儿按年龄组分析，学龄前儿童(3～6岁)占比例最高(144例，50%)，其次为幼儿(38.2%)和学龄儿童(11.8%)，与2014年张昕婷等的结果一致[17]。

无锡地区下呼吸道感染病原菌中肺炎克雷伯杆菌最常见，其次为金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，未检测出大肠埃希菌，肺炎衣原体及结核杆菌。与谢莹莹，梁卓夫等报道的以革兰氏阴性菌为主相符[18]；与苏州地区小儿下呼吸道感染以肺炎链球菌和流感嗜血杆菌为主的报道不同[19]。冯燕玲等报道北京地区儿童呼吸道感染的主要病原菌为SP，HI，SA，SE，KP，与本研究相符。细菌检出率与患儿性别有关，女性高于男性，与苏州地区等报道的结果一致。且本研究中细菌检出率随年龄增长有下降趋势，<1岁组患儿阳性检出率最高，>7岁组儿童阳性检出率最低，与其他地区的报道一致[19]，可能是由于幼儿的器官及生理功能尚未发育健全，呼吸道粘膜脆弱，粘膜血流量少，且自身免疫功能也尚未发育完善。本研究中，存在混合感染的标本为10例，占感染数的16.9%，高于之前的报道，最常见的合并感染为SA+HI+PA及KP+PA。以往研究中，关于肺炎支原体与病毒合并感染的报道较多，与细菌合并感染的报道较少，本研究中MP合并感染率为23.5%(4/17)，与Wujun Jiang等的报告比例(102/330，30.9%)类似[20]，最容易与KP合并感染。

综上所述，本研究通过对2015年春季无锡地区儿童肺炎支原体及其他呼吸道常见致病菌的分析，肺炎支原体及其他呼吸道常见致病菌阳性检测率为20.5%，其中肺炎支原体及肺炎克雷伯杆菌为主要致病菌，女性及<1岁组，细菌感染较其他组常见。由于肺炎支原体感染与其它儿童常见病原菌感染治疗方案有差异且肺炎支原体耐药率较高，了解本地区肺炎支原体与其它病原菌分布情况，有助于临床医生快速诊断，合理用药，从而缩短疗程，降低治疗费用，避免滥用抗菌药物，减少耐药菌株的产生。由于本研究标本收集时间段较短，病例数较少，对肺炎支原体耐药与临床病情之间的关系尚不明确，有必要进一步追踪监测。

[1] Al-Marzooq F, Imad MA, How SH, et al. Development of multiplex real-time PCR for the rapid detection of five bacterial causes of community acquired pneumonia[J]. Trop Biomed, 2011, 28 (3): 545-556.

[2] Waites KB, Talkington DF.Mycoplasmapneumoniaeand its role as a human pathogen[J]. Clin Microbiol Rev, 2004, 17 (4): 697-728. DOI:10.1128/CMR.17.4.697-728.2004

[3] Walter ND, Grant GB, Bandy U, et al. Community outbreak ofMycoplasmapneumoniaeinfection: school-based cluster of neurologic disease associated with household transmission of respiratory illness[J]. J Infect Dis, 2008, 198 (9): 1365-1374.

[4] Mustafa MI, Al-Marzooq F, How SH, et al. The use of multiplex real-time PCR improves the detection of the bacterial etiology of community acquired pneumonia[J]. Trop Biomed, 2011, 28(3): 531-544.

[5] Yan C, Sun HM, Xue GH, et al. A single-tube multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis ofMycoplasmapneumoniaeclinical specimens by use of multiplex PCR-capillary electrophoresis[J]. J Clin Microbiol, 2014, 52 (12): 4168-4171. DOI: 10.1128/JCM.02178-14

[6] Lin C, Li S, Sun H, et al. Nested PCR-linked capillary electrophoresis and single-strand conformation polymorphisms for detection of macrolide-resistantMycoplasmapneumoniaein Beijing, China[J]. J Clin Microbiol, 2010, 48 (12): 4567-4572. DOI: 10.1128/JCM.00400-10

[7] Feng YL, Xue GH, Xu WJ, et al. Development of a multiplex PCR assay for simultaneous detection of five major pathogenic bacteria of respiratory diseases in children[J]. Chin J Biologicals, 2012, 25 (12): 1692-1696. (in Chinese)

冯燕玲, 薛冠华, 徐文健, 等. 儿童呼吸道易感病原菌多重PCR检测方法的建立 [J]. 中国生物制品学杂志, 2012, 25 (12): 1692-1696.

[8] Teng Y, Xie JJ, Xie GQ, et al. The relationship between mycoplasma antibodies with eosinophils in pediatric acute bronchial pneumonia[J]. Tianjin Med J, 2007, 35 (9): 693-694. (in Chinese)

滕源, 谢娟娟, 谢国强, 等. 小儿急性支气管肺炎支原体抗体与嗜酸性粒细胞的关系[J]. 天津医药, 2007, 35 (9): 693-694.

[9] Zhou XM, Tong X. Application of quickly identification media rapid in the diagnosis and clinical analysis of pediatricMycoplasmapneumoniae[J]. Harbin Med J, 2007, 27 (5): 4-5. (in Chinese)

周雪梅, 童晓.小儿支原体肺炎应用肺炎支原体快速鉴定培养基快速诊断及临床分析[J]. 哈尔滨医药, 2007, 27 (5): 4-5.

[10] Xiang HX, Yu ZW, Xie JJ, et al. Epidemiological research onMycoplasmapneumoniaeinfection in children lived in Wuxi area from 2008 to 2010[J]. Mod Prevent Med, 2013, 40 (13): 2438-2439. (in Chinese)

项红霞, 郁志伟, 谢娟娟, 等. 无锡地区2008-2010年儿童肺炎支原体感染流行病学研究[J]. 现代预防医学, 2013, 40 (13): 2438-2439.

[11] Zhao HQ, Li SL, Cao L, et al. Surveillance ofMycoplasmapneumoniaeinfection among children in Beijing from 2007 to 2012[J]. Chin Med J, 2014, 127 (7): 1244-1248. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0366-6999.20131654

[12] Dumke R, von Baum H, Luck PC, et al. Occurrence of macrolide-resistantMycoplasmapneumoniaestrains in Germany[J]. Clin Microbiol Infect, 2010, 16 (6): 613-616. DOI: 10.1111/j.1469-0691.2009.02968.x

[13] Diaz MH, Benitez AJ, Winchell JM. Investigations ofMycoplasmapneumoniaeinfections in the United States: trends in molecular typing and macrolide resistance from 2006 to 2013[J]. J Clin Microbiol, 2015, 53 (1): 124-130. DOI: 10.1128/JCM.02597-14

[14] Matsuda K, Narita M, Sera N, et al. Gene and cytokine profile analysis of macrolide-resistantMycoplasmapneumoniainfection in Fukuoka, Japan[J]. BMC Infect Dis, 2013, 13: 591. DOI: 10.1186/1471-2334-13-591

[15] Sun H, Xue G, Yan C, et al. Multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis ofMycoplasmapneumoniaeclinical specimens and proposal for amendment of MLVA nomenclature[J]. PLoS ONE, 2013, 8 (5): e64607. DOI: 10.1371/journal.pone.0064607

[16] Liu Y, Ye X, Zhang H, et al. Multiclonal origin of macrolide-resistantMycoplasmapneumoniaeisolates as determined by multilocus variable-number tandem-repeat analysis[J]. J Clin Microbio, 2012, 50 (8): 2793-2795. DOI: 10.1128/JCM.00678-12

[17] Zhang XT, Zhang JY, Cao AH. Epidemiological investigation on respiratory diseases in 1 300 children, in Jinan, Shandong[J]. Chin J Epidemiol, 2014, 35 (17): 1275-1277. DOI: 1.3760/cma.j.issn.0254-6450.2014.11.022 (in Chinese)

张昕婷, 张俊英, 曹爱华 . 济南市1 300例儿童呼吸道疾病流行病学分析[J]. 中华流行病学杂志, 2014, 35 (17): 1275-1277.

[18] Xie YY, Chen CB, Wang M, et al. Analysis of sputum culture and drug susceptibility in Children with lower respiratory infection[J]. J Clin Pulmon Med, 2015, 20 (2): 354-355. DOI: 10.3969/j.issn.1009-6663.2015.02.053 (in Chinese)

谢莹莹, 陈春宝, 王敏, 等. 儿童下呼吸道感染痰培养及药敏结果分析[J]. 临床肺科杂志, 2015, 20 (2): 354-355.

[19] Sun QF, Chen ZR, Huang L, et al. Bacterial etiology and their drug resistance in hospitalized children with lower respiratory tract infections in Suzhou during 2008 and 2012[J]. Chin J Clin Infect Dis, 2014, 7 (1): 39-44. DOI: 10. 3760/cma.j.issn.1674-2397.2014.01.008 (in Chinese)

孙秋风, 陈正荣, 黄莉等. 2008至2012年苏州地区住院患儿下呼吸道感染细菌病原学分布及耐药性分析[J]. 中华临床感染病杂志, 2014, 7 (1): 39-44.

[20] Jiang W, Yan Y, Ji W, et al. Clinical significance of different bacterial load ofMycoplasmapneumoniaein patients withMycoplasmapneumoniaepneumonia[J]. Braz J Infect Dis, 2014, 18 (2):124-128. DOI: 10.1016/j.bjid.2013.06.004

Distribution ofMycoplasmapneumoniaeand respiratory pathogens in the specimen collected from Wuxi in the spring of 2015

CHANG Qing1, YAN Chao2, YU Rong1, GAO Yan-min1, OU YANG Bing1, SUN Hong-mei2

(1.DepartmentofPediatrics,WuxiNo.8People’sHospitalGroup,Wuxi214016,China;2.DepartmentofBacteriology,CapitalInstituteofPediatrics,Beijing100020,China)

We explored the distribution ofMycoplasmapneumoniaeand other respiratory pathogens in the specimens collected from children with respiratory infection in Wuxi. PCR was used to detectMycoplasmapneumoniaeand 10 respiratory pathogens, and nPCR-SSCP-CE was used to detect the mutations associated with macrolide resistance. Results showed that one or more pathogens were detected in 59 of 288 specimens, and the positive rate was 20.5%. The children <2 years old and the female were susceptible. Results indicated that 28.8% (17/59) wereMycoplasmapneumoniae, 30.5% (18/59) were KP, 20.3% (12/59) were SA, 20.3% (12/59) were PA, 15.3% (9/59) were SE, 10.2% (6/59) were HI, 5.08% (3/59) were SP, 5.08% (3/59) were LP, and EC, CP, TB were 0%, respectively. The mutation rate of macrolide associate resistance toMycoplasmapneumoniaewas 88.2%, and the co-infection were detected in 10 specimens.The most common pathogens wereMycoplasmapneumoniaeand Kp in Wuxi and there was a high rate of macrolide resistance.

Mycoplasmapneumoniae; microlide resistance; respiratory pathogens; pediatrics; Wuxi

Sun Hong-mei, Email: s.hongmei@263.net

孙红妹，Email：s.hongmei@263.net

1.江苏省无锡市第八人民医院儿科，无锡214016；2.首都儿科研究所细菌研究室，北京100020

R375

A

1002-2694(2016)07-0636-05

2015-12-04；

2016-02-14

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.009

无锡市卫生计生委妇幼健康科研项目(No.FYKY201505)