HPLC法同时测定红枣及其制品中3种防腐剂

黄岛平，江思华，林葵，*，陈建红，苏梅清，黄祖林，黄文琦，黎颖（.广西分析测试研究中心，广西南宁5300；.广西师范学院，广西南宁53000）

HPLC法同时测定红枣及其制品中3种防腐剂

黄岛平1，江思华2，林葵1，*，陈建红1，苏梅清1，黄祖林1，黄文琦1，黎颖1
（1.广西分析测试研究中心，广西南宁530022；2.广西师范学院，广西南宁530001）

为探查红枣中未知有害添加物，采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定红枣及其制品中山梨酸、苯甲酸和脱氢乙酸含量。结果表明：浓度在12.5μg/mL～100μg/mL范围内，苯甲酸、山梨酸与脱氢乙酸成良好的线性关系，标准曲线分别为y=3×106x-53 924，r=0.999 9；y=6×106x-114 017，r=0.999 9；y=3×106x-84 592，r=0.999 9；最低检测限分别为0.36、0.38、0.56 mg/kg；平均回收率分别为101.4%、100.6%、100.2%。结果发现，43批不同产地不同品种红枣及其制品中，脱氢乙酸未检出；1批红枣制品检出山梨酸（0.072 8 g/kg）；23批红枣检出苯甲酸（0.009 5 g/kg～0.118 0g/kg），并经质谱定性确证。

高效液相色谱法；红枣；红枣制品；山梨酸；苯甲酸；脱氢乙酸

红枣在我国已有4 000多年栽培历史了，主要分布河南、河北、山西、陕西、山东、新疆等地，有“天然维生素丸”的美誉，营养价值高，又具有一定的药用价值，深受广大消费者的喜爱。我国枣资源丰富，据报道有枣品种736个，制干或鲜食制干品种占30.4%，共有224个[1]。随着经济的发展，人们的生活水平不断提高，消费者对食品的安全性日益关注。为防止食品腐败变质，保持食品的鲜度，化学添加剂广泛用于各种食品和饮料。苯甲酸由于其低成本，常常被不法厂商滥用于食品和药品中。食入过量的化学添加剂具有潜在的毒害，对人体的毒性主要有致畸性、致癌性和致突变性[2]。为了研究红枣中未知添加物，2013年承担广西科技厅项目并开始调查，2014年采样检测其中苯甲酸完成论文初稿后，发现孙屏[2]等对新疆红枣中苯甲酸含量进行了调查研究，在新疆红枣中检出苯甲酸，并走访产业链，证实为天然苯甲酸，含量最高为153 mg/kg，在95%置信水平下骏枣中苯甲酸含量处于74 mg/kg～95 mg/kg；丁春瑞等用毛细管气相法测定了其中甜蜜素[4]。检测方法中，国家标准有3个[5-7]，学术论文中罗成玉对果冻中苯甲酸等5种成分进行了检测研究[8]。不法商贩为了利益最大化，也有可能怀着侥幸心理，违法添加防腐剂以使产品存放时间延长。为此，本文检测了新疆红枣，本地市场鲜枣、及红枣制品中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸含量，除对苯甲酸进行质谱定性外，还建立了3种防腐剂同时检测的液相色谱方法。

1　材料与方法

1.1仪器、试剂和样品

Waters ALLIANCE 2695高效液相色谱系统，配Waters2996二级管阵列检测器，Empower色谱工作站、Waters XEVO G2-S QTOF/MS四极杆飞行时间串联质谱仪：美国沃特世公司；T25基本分散器：德国IKA公司；CGR22G超高速冷冻离心机：日本日立公司；AB204电子天平：瑞士梅特勒公司；HR2864，325W粉碎机：飞利浦公司；KQ5200超声波清洗器：昆山市超声仪器公司。

苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸：均购买于中国标准物质中心；甲醇：色谱纯，默克公司、乙酸铵：分析纯，成都市科龙化工试剂厂；亚铁氰化钾、冰乙酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；乙酸锌：分析纯，广东光华科技股份有限公司；超纯水：北京爱思泰克科技开发有限责任公司逆渗透纯水机制备。

乙酸铵溶液（0.02 mol/L）：称取1.54 g乙酸铵，加水至1 000 mL溶解，经0.45μm水膜过滤。

亚铁氰化钾溶液：称取106 g亚铁氰化钾[K4Fe （CN）6·3H2O]溶液加水至1 000 mL。

乙酸锌：称取220 g乙酸锌[Zn（CH3COO）2·2H2O]，溶于少量水中，加入30 mL冰乙酸，加水稀释至1 000 mL。

样品来源：红枣及其制品采购于南宁市南城百货、沃尔玛超市、华联超市；鲜枣采购于农贸市场。

1.2方法

1.2.1标准溶液及其配制

1.2.1.1苯甲酸标准储备液1.00 mg/mL

准确称取苯甲酸钠标准品0.236 0 g，加水溶解并定容至200 mL，此溶液每毫升含苯甲酸1.00 mg。

1.2.1.2山梨酸标准储备液1.00 mg/mL

准确称取山梨酸钾标准品0.268 0 g，加水溶解并定容至200 mL，此溶液每毫升含山梨酸1.00 mg。

1.2.1.3脱氢乙酸标准储备液1.00 mg/mL

准确称取脱氢乙酸标准品0.100 0 g，用10 mL 20 g/L的氢氧化钠溶液溶解，用水定容至100 mL。

1.2.1.4混合标准使用液

分别吸取不同体积苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸标准储备溶液，用水稀释，使标准系列浓度为0.000、0.010、0.020、0.040、0.050、0.080 mg/mL。

1.2.2供试品溶液的制备

称取2 g粉碎后的红枣样品，于50 mL的比色管中，加入20 mL水，超声震荡提取10 min，并于旋涡混合器上剧烈混合2 min，分别加入2 mL的亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液，摇匀，最后用水定容至刻度。移入离心管，于10 000 r/min离心10 min，吸出上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤上机待定。

1.2.3色谱条件

色谱柱为AtlantisRT3柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相：A相为甲醇，B相为乙酸铵溶液（0.02 mol/L），梯度洗脱程序见表1。

表1　流动相梯度洗脱程序Table 1　Mobile phase gradient elution program

流速1 mL/min；柱温25℃；变波长测定：0～20 min，230 nm；20 min～30 min，293 nm，进样量为10μL。1.2.4液质条件

液相条件：色谱柱：Waters Acquity BEHC18，1.7μm，2.1 mm×100 mm；流动相：0.1%甲酸水溶液∶乙腈=95∶5（体积比）；流速0.4 mL/min；运行时间：5 min；吸收波长：230 nm；柱温：35℃；进样体积：1.00μL。

质谱条件：离子源：大气压电喷雾离子源（ESI）；负离子检测模式；毛细管压力：2.7 kV；源温度：100℃，源补偿：80 V；锥孔气流：30 L/h；溶剂温度：300℃；溶剂气流：800 L/h；碰撞能量：6 V；检测能量：2 575 V；扫描范围：100 m/z～400 m/z。

2　结果与讨论

2.1苯甲酸的定性与定量

在“1.2.3”规定的色谱条件下，混合标准溶液的色谱图如图1所示。

图1　混合标准溶液的色谱图Fig.1　The chromatography ofmixed standard solution

浓度为0.05 mg/mL。样品编号按采用时间先后顺序进行编号。样品信息见表2。

表2　样品信息Table 2　The information ofsamples

图2为样品L-06的色谱图。

图2　样品L-06的色谱图Fig.2　The chromatography of sample L-06

同时取苯甲酸标准品与供试品L-06与L-28，进行液质对照分析（条件见1.2.4），发现标准品与供试品在相对分子质量MS=121.029有明显的苯甲酸特征质谱信号峰，见图3、图4、图5，证实了红枣样品中确实存在苯甲酸。

2.2线性关系

以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，计算得出苯甲酸，山梨酸，脱氢乙酸的线性方程分别为y=3× 106x-53 924，r=0.999 9；y=6×106x-114 017，r=0.999 9；y=3×106x-84 592，r=0.9999；。最低检测限分别为0.36、0.38、0.56 mg/kg。结果表明，苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸在12.5μg/mL～100μg/mL范围内与其峰面积积分值呈现出良好线性关系。

2.3精密度试验

精密吸取混合标准溶液（50μg/mL）10μL，重复进样6次，测定峰面积，计算得苯甲酸、山梨酸与脱氢乙酸的RSD分别为0.48%，0.65%，0.16%，表现精密度良好。2.4回收率与重复性试验

图3　苯甲酸的标准溶液的质谱图谱Fig.3　The MS spectra ofbenzoic acid standard solution

图4　L-06样品的质谱图Fig.4　The MS spectra ofsample L-06

图5　L-28样品的质谱图Fig.5　The MS spectra ofsample L-28

称取已知含量的L-06样品6份，加入一定量苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸对照品，按供试品溶液的制备方法进行操作，测定含量，计算回收率与重复性，结果分别见表3、表4、表5。

表3　苯甲酸回收率试验结果Table 3　The result ofrecovery for benzoic acid

经计算苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸的平均回收率分别为：101.4%、100.6%、100.2%，RSD分别为0.73%、0.82%、0.69%。结果表明该方法的回收率与重复性较好。

表4　山梨酸回收率试验结果Table 4　The result ofrecovery for sorbic acid

表5　脱氢乙酸回收率试验结果Table 5　The result ofrecovery for dehydroacetic acid

2.6样品的测定

按上述处理方法和色谱条件，检测不同批次红枣、本地市场鲜枣（干燥）及红枣制品中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸的含量，测试结果如表6、表7、表8所示。

表6　红枣中检测结果Table 6　The detection resultofjujube

表7　本地鲜枣干燥后测试结果Table 7　The detection resultoflocalfresh jujube after being dried

3　结论

1）本试验采用高压液相色谱法同时测定红枣及其制品中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸含量，精密度好，回收率高，方法检出限等满足实际工作需要。

2）从表6、表7、表8的测试结果看出，43个样中，均未检出脱氢乙酸，检出率为0；其中有23个检测出苯甲酸（0.009 5 g/kg～0.118 0 g/kg），苯甲酸检出率53%；1个样品检出山梨酸，检出率为2.3%。

22个红枣样品，主要产地为新疆，其他产地为河南、山东、陕西各一个，山梨酸、脱氢乙酸均未检出，而20个红枣中检出苯甲酸，含量为0.009 5 g/kg～0.118 g/kg （0.059 9±0.032 2）g/kg，检出率91%。质谱定性确证为苯甲酸。为了证实红枣中检出的苯甲酸是其本身带有或人为添加，在本地南宁市采集了10个鲜枣样品（来自新疆等地），烘干后检测了其中3种防腐剂含量，均未检出。按常规来判断，防腐剂中含量小于0.1 g/kg时，一般可考虑为天然含有或加工中随原辅料（或加工助剂）带入。红枣为未加工，初步判定为本身带有，与文献[3]结论吻合。只有2个红枣样品苯甲酸含量超过0.1 g/kg的3%～18%，占检出产品中的10%，或为检出误差，或存在少量的安全隐患。新疆、山东、河南、陕西红枣大部分含苯甲酸，少部分不含，说明不同地域、不同品种有差异；而在本地购买的鲜枣没有检出苯甲酸，可能因其运输链长，成熟度不够即采摘装箱，还未来得及产生苯甲酸。

表8　红枣制品中测试结果Table 8　The detection resultofjujube products

本项目同时测定了11个红枣制品中3种防腐剂含量，其中3个检出苯甲酸，范围在0.010 5 g/kg～ 0.080 3 g/kg，1个检出山梨酸（0.072 8 g/kg），脱氢乙酸未检出。根据GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[8]中蜜饯凉果类规定，苯甲酸、山梨酸允许添加量均为0.5 g/kg，脱氢乙酸不能添加。所检测的红枣制品中3种防腐剂含量均符合要求。

本次检测调查说明，红枣及其制品中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸违法添加风险不大。

[1]梁洪.中国红枣及红枣产业的发展现状、存在问题和对策的研究[D].西安:陕西师范大学,2006

[2]王晶.食品安全快速检测技术[M].北京:化学工业出版社,2001:9-12

[3]孙屏,吕岳文,刘超,等.新疆红枣中天然苯甲酸含量的调查研究[J].新疆农业科学,2014,51(2):235-240

[4]中华人民共和国卫生部,中国国家标准管理委员会.GB/T 5009. 29-2003食品中山梨酸、苯甲酸的测定[S].北京:中国标准出版社,2003

[5]中华人民共和国卫生部,中国国家标准管理委员会.GB/T 5009. 121-2003食品中脱氢乙酸的测定[S].北京:中国标准出版社, 2003

[6] 中华人民共和国卫生部,中国国家标准管理委员会.GB/T 23495-2009食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定[S].北京:中国标准出版社,2009

[7]罗成玉.果冻中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸同时测定方法[J].上海计量测试,2013,233(1):18-20

[8]中华人民共和国卫生部,中国国家标准管理委员会,GB 2760-2014食品安全国家标准食品添加剂使用标准[S].北京:中国标准出版社,2014

Simultaneous Determination of Three Preservatives in Jujube and Its Products by High Performance Liquid Chromatography

HUANG Dao-ping1，JIANG Si-hua2，LIN Kui1，*，CHEN Jian-hong1，SU Mei-qing1，HUANG Zu-lin1，HUANG Wen-qi1，LIYing1
（1.GuangxiResearch Centre ofAnalysis，Nanning 530022，Guangxi，China；2.GuangxiTeacher's College，Nanning 530001，Guangxi，China）

To find the unknown injurious additives in jujube，High Performance Liquid Chromatography （HPLC）was used to determine benzoic acid，sorbic acid and dehydroacetic acid in jujube.The results showed that benzoic acid，sorbic acid and dehydroacetic acid had good linear relations when the concentration was in the range of12.5μg/mL-100μg/mL.Standard curves were y=3×106x-53 924，r=0.999 9；y=6×106x-114 017，r=0.999 9；y=3×106x-84 592，r=0.9999.The average recoveries of benzoic acid，sorbic acid and dehydroacetic acid were 101.4%，100.6%，100.2%.Their lowestlimits ofdetection were 0.36，0.38，0.56 mg/kg.In addition，Dehydroacetic acid had not been detected among 43 kinds ofdifferent habitats and species of jujube and its related products.Sorbic acid had been detected in one sample（0.072 8 g/kg）.And benzoic acid had been detected in 23 samples（0.009 5 g/kg-0.0118 0 g/kg）.Above detections had proved by Mass Spectrometer.

HPLC；jujube；jujube products；benzoic acid；sorbic acid；dehydroacetic acid

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.030

广西六类主要食品中安全质量分析及违法添加物质检测技术的研究（桂科攻1355010）；防腐剂、真菌毒素及污染物的固相萃取快速检测技术研究与应用（桂科能14123006-20）

黄岛平（1965—），男（汉），高级工程师，学士，研究方向：食品检测及方法研究。

林葵，高级工程师，学士，研究方向：食品营养成分、检测及方法研究。

2015-05-24