响应面法优化复合酶酶解牡蛎蛋白的工艺研究

文志州（佛山市海天调味食品股份有限公司，广东佛山528000）

响应面法优化复合酶酶解牡蛎蛋白的工艺研究

文志州
（佛山市海天调味食品股份有限公司，广东佛山528000）

为提高牡蛎蛋白的利用率，以新鲜牡蛎为原料，采用水解蛋白酶与风味蛋白酶对新鲜牡蛎进行复合酶解，并利用响应面法对牡蛎酶解工艺参数进行优化。结果表明：牡蛎蛋白的最优酶解条件为，复合酶的加酶量为0.70%、pH6.87，酶解温度58.6℃，酶解时间为3.4 h。在此条件下，新鲜牡蛎酶解后的水解度最高，为40.71%。

牡蛎；复合酶解；响应面分析法；水解度

牡蛎又名蚝，是世界上第一大养殖海产贝类，全球发现有100多种，主要分布在热带和温带，为我国四大养殖贝类之一。我国沿海牡蛎分布较广，自渤海、黄海至南沙群岛均有生长，约有20种[1]。牡蛎肉鲜味美，营养丰富，素有“海底牛奶”之称[2]，是我国首批列为药食同源的保健食品之一[3]。牡蛎中的蛋白含量高达50%，其中必需氨基酸占氨基酸总量的40%，是一种优质的蛋白质资源。牡蛎肉中富含牛磺酸，牛磺酸具有消炎解毒、降血脂、促进幼儿大脑发育等作用[4]。此外，牡蛎肉的糖原含量丰富，约为22.41%，是一种重要的生理活性物质，可改善心脏和血液功能[5]。且蚝肉中还含有DHA和EPA等不饱和脂肪酸、维生素以及硒和锌等矿物质，具有一定的保健功能[6]。

蚝汁是蚝油生产的主要原料，其质量优劣对蚝油的质量有重要的影响。目前，蚝汁的生产方式主要有两种：一是煮制工艺，直接利用牡蛎蒸、煮后的汁液进行浓缩制得。另一种是酶解工艺，将蚝肉酶解，再对酶解液进行处理制得蚝汁[7]。通过酶解法制备蚝汁，不仅可以提高蛋白的利用率，还能增加酶解液中的营养成分及功能活性物质。酶解工艺多采用单酶或双酶水解法，且采用的单酶多为胰蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶等[8-10]。双酶多采用中性蛋白酶和风味蛋白酶等的组合[11]。本试验采用水解蛋白酶与风味蛋白酶对牡蛎进行复合酶解，利用响应面法对牡蛎酶解工艺参数进行优化，得出了牡蛎双酶酶解的最佳工艺条件，提高牡蛎肉的水解度，增加牡蛎蛋白的利用率，为牡蛎的深加工和综合利用提供理论依据。

1　材料和方法

1.1材料与试剂

新鲜牡蛎：海南东岸水产开发有限公司；风味蛋白酶（100 000 U/g）、水解蛋白酶（100 000 U/g）、中性蛋白酶（100 000 U/g）、木瓜蛋白酶（200 000 U/g）、复合蛋白酶（120 000 U/g）：诺维信公司；分析纯氯化钠、氢氧化钠等：国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

1030Analyzer定氮仪：Tetator；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱：北京市雅士林试验设备有限公司；Delta 320 pH计：梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司；3-18K冷冻离心机：德国sigma。

1.3方法

1.3.1基本成分的测定

水分含量的测定：参照GB 5009.3-2010《食品安全国家标准食品中水分的测定》采用常压干燥法进行；粗脂肪含量的测定：参照GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的测定》采用索氏提取法；灰分含量的测定：参照GB 5009.4-2010《食品安全国家标准食品中灰分的测定》采用干法灰化法测定；粗蛋白含量的测定：参照GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测》采用凯氏定氮法测定；总糖含量的测定：参照GB/T 9695.31-2008《肉制品总糖含量测定》。

1.3.2蚝汁的制备工艺

取一定量的新鲜牡蛎，加入一定量的水，打浆处理，加入一定量的蛋白水解酶，在适宜的酶解条件下，酶解一定时间后，100℃煮沸10 min灭酶，冷却后3 000 r/min离心15 min，得到蚝汁。

1.3.3蛋白质水解度的测定

水解度的测定采用甲醛滴定法[12]。水解度是指蛋白质分子中由于生物或化学水解而断裂的肽键占蛋白质分子中总肽键的比例。DH/%=水解液中断裂的肽键数/蛋白质中总的肽键数×100

1.3.4数据处理

试验所涉及到的测定结果均做3次平行，试验数据用Origin8.6进行数据处理，用SPSS软件进行显著性分析处理。

2　结果与讨论

2.1蚝肉的主要成分分析

蚝肉的主要成分见表1。

表1　蚝肉的主要成分Table 1　Chemicalcomposition ofoyster meat

由表1可知，解冻后的蚝肉中的主要成分为水分，水分含量为80.64%，而蚝肉的干物质中，蛋白质的含量最高，占49.83%，且其氨基酸的组成较为合理，必需氨基酸含量较高，占氨基酸总量的40.00%，是一种优质蛋白质[13]。蚝肉中还含有约3.30%的牛磺酸，对人体具有很重要的生理活性[14]。其次是糖类，占干物质的24.08%，其中含有大量的活性多糖，能改善心脏和血液功能，对人体有良好的保健作用[15]。蚝肉中的脂肪含量较低，仅为7.14%，且其脂肪中的DHA、EPA等不饱和脂肪酸的比例较高，能改善和提高记忆力[6]。蚝肉中的灰分含量较高为9.49%，含有丰富的微量元素，特别是锌和硒的含量丰富[17]。

2.2响应面优化水解蛋白酶与风味蛋白酶复合酶解牡蛎的工艺条件

在单因素试验基础上（单因素试验结果为水解蛋白酶∶风味蛋白酶=2∶1（体积比），酶解温度60℃、加酶量0.6%、pH=7、酶解时间3 h），选取加酶量（A）、pH （B）、酶解温度（C）、酶解时间（D）4个因素为自变量，以水解度（Y）为目标函数，采用四因素三水平的响应面分析法进行试验设计，其因素水平编码表如表2所示。

表2　响应面优化因素及水平表Table 2　Factors and levels of RSMexperiment

根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，按表2的因素水平编码表，以水解度（Y）为响应值，采用四因素三水平的响应面分析方法进行试验设计，试验设计及结果如表3所示。

表3　响应面分析方案及结果Table 3　Response surface experimentaldesign and results

续表3　响应面分析方案及结果Continue table 3　Response surface experimentaldesign and results

利用Design Expert8.0.6软件对上表中的试验结果作回归拟合分析，得到Y水解度（%），A加酶量（%），B pH，C酶解温度（℃），D酶解时间（h）二次项方程：Y=37.16＋2.79×A-2.95×B-1.13×C＋1.95×D-0.51×A× B-2.86×A×C＋0.35×A×D＋1.29×B×C＋-1.33×B×D-0.51× C×D－3.91×A2－3.40×B2－4.27×C2－0.66×D2。对方程分别进行显著性方差分析和可信度分析，结果分别如表4和表5所示。

表4　二次回归方程的显著性检验及方差分析Table 4　ANOVA for response surface quadratic model

表5　二次回归方程的可信度分析Table 5　The credibility analysis ofregression model

由上表可知：P﹤0.000 1，故该回归模型极显著，其中的一次项A、B、C、D和二次项A2、B2、C2表现为极显著，二次项D2表现为显著。而交互项AC、BC、BD表现为极显著，AC、AD、CD表现为不显著。由表6中F值可以看出，加酶量（A）、pH（B）、酶解温度（C）及酶解时间（D）4个因素中，pH对牡蛎蛋白水解度的影响最大，其次是加酶量、酶解时间，最后是酶解温度。同时失拟项P=0.340 6，为不显著，表明失拟误差相对于纯误差是不显著的，同时该模型具有较好的回归系数（R2=0.98）说明该试验设计是可靠的，能够很好地描述试验结果。

图1直观地反映出各因素间的交互效应以及对牡蛎蛋白水解度的影响。

图1　四因素的等高线图及响应面三维分析图Fig.1　Four-dimensionalchart and corresponding contour plot

其中酶解温度-加酶量、pH-加酶量及酶解时间-加酶量的交互作用对牡蛎蛋白水解度的影响较为显著。由图1可知，其他几种因素的交互作用对牡蛎蛋白水解度也存在一定影响。因此，当提取温度、保温时间、加酶量及酶解时间4个因素间合理组合时才能获得较好的水解度。

综合以上单因素试验及响应面分析试验结果，使用Design-expert软件，得到水解度最高的新鲜牡蛎的复合酶解条件如下：加酶量为0.70%、pH=6.87，酶解温度58.57℃，酶解时间为3.39 h时，酶解后的水解度最高，为40.50%。按照确定的最佳酶解条件进行3次实际酶解试验，实际酶解条件为，加酶量0.70%、pH= 6.87、酶解温度58.6℃、酶解时间3.4 h，并测定此时酶解液的水解度，所得的实际水解度为（40.71±1.03）%，说明所建立的试验模型能够真实的反应4种因素对牡蛎蛋白酶解效果的影响，所得的酶解条件可靠稳定，对实际生产具有一定的指导作用。

3　结论

本研究以新鲜牡蛎为原料，采用水解蛋白酶与风味蛋白酶对牡蛎蛋白进行复合酶解，利用单因素试验和响应面法对牡蛎蛋白酶解工艺参数进行优化，得出了牡蛎双酶酶解的实际最佳工艺条件为复合酶中水解蛋白酶与风味蛋白酶的复配比例为2∶1（体积比），复合酶加酶量为0.70%、pH=6.87，酶解温度58.6℃，酶解时间为3.4 h，在此条件下，新鲜牡蛎酶解后的水解度最高，为40.71%。

[1] 徐静.牡蛎提取物的降血糖活性研究[D].济南:山东大学,2005: 7-8

[2] 滕瑜,乔向英.牡蛎酶解工艺条件的研究[J].海洋水产研究,1997, 18(1):112-116

[3]陈必链,王绍钊.牡蛎水提取氨基酸的研究[J].适用技术市场, 1998(4):25-26

[4]谭乐义,章超桦,薛长湖,等.牛磺酸的生物活性及其在海洋生物中的分布[J].湛江海洋大学学报,2000,20(3):75-79

[5]毛文君,李翊.海洋功能食品的研究开发(二)[J].中国海洋药物, 1997,61(3):50-53

[6]顾聆琳.牡蛎中风味物质的研究及调味料的制备[D].无锡:江南大学,2005:1-4

[7] 邓尚贵,章超桦.酶法制造出口蚝汁的加工工艺[J].食品科技,1999, 12(3):24-25

[8] 滕瑜,乔向英.牡蛎酶解工艺条件的研究[J].海洋水产研究,1997, 18(1):112-116

[9]Kim D S,Baek H H,Ahn C B,etal.Developmentand characterization of a flavoring agent from oyster cooker effluent[J].Journalofagriculturaland food chemistry,2000,48(10):4839-4843

[10]Chuapoehuk P,Raksakulthai N.Use of papain and bromelin in the production of oyster sauce[J].Kasetsart Journal:Natural Science (Thailand),1991,7(8):383-386

[11]王亮,杜卫华,孙金才.牡蛎肉双酶复合水解工艺[J].无锡轻工大学学报,2003,22(3):97-100

[12]赵新淮,冯志彪.蛋白质水解物水解度的测定[J].食品科学,1994 (11):65-67

[13]汪何雅,杨瑞金,王璋.牡蛎的营养成分及蛋白质的酶法水解[J].水产学报,2003,27(2):163-168

[14]李清选.牡蛎保健食品及国外开发的概况[J].中国海洋药物, 1989,35(2):47-52

[15]张梅超.牡蛎蛋白酶解液风味改善及其运动饮料的研制[D].青岛:中国海洋大学,2014:1-2

[16]章超桦,洪鹏志,邓尚贵,等.翡翠贻贝肉的食品化学特性及其在海鲜调味料的应用[J].水产学报,2000,3(3):267-270

Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Oyster Protein Using Response Surface Methodology

WEN Zhi-zhou
（Foshan Haitian Flavouring and Food Co.，Ltd.，Foshan 528000，Guangdong，China）

In order to improve the utilization of oysters protein.Fresh oysters was used as raw material，The fresh oysters was hydrolyzed with proteolytic enzyme and flavourzyme.And then the Box-Behnken response surface method was used to optimize the combination of enzymatic hydrolysis process.Results showed that the best conditions for oysters proteolysis was the quantity of compound enzyme was 0.70%，pH 6.87，the enzyme hydrolysis temperature 58.6℃，the hydrolysis time was 3.4 h.Under this condition the hydrolysis degree was the highest，which was 40.71%.

oyster；enzymatic hydrolysis；response surface methodology；degree ofhydrolysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.022

文志州（1978—），男（汉），工程师，本科，研究方向：食品调味料研发与管理。

2016-01-28