金针菇下脚料多糖脱色工艺及其抑菌活性

陈义勇，黄友如，刘晶晶，郑丽雪，冀宏，邱丽青，曹亚军（.常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟5500；.张家港市常兴菌业有限公司，江苏张家港563）

金针菇下脚料多糖脱色工艺及其抑菌活性

陈义勇1，黄友如1，刘晶晶1，郑丽雪1，冀宏1，邱丽青1，曹亚军2
（1.常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟215500；2.张家港市常兴菌业有限公司，江苏张家港215623）

以金针菇下脚料为原料，采用水浴浸提法提取金针菇多糖，以蛋白脱除率、多糖保留率和脱色率为指标，探讨金针菇下脚料多糖聚酰胺柱层析脱色工艺，并对金针菇下脚料多糖的抑菌活性进行研究。结果表明：聚酰胺层析法为金针菇下脚料多糖最佳的脱蛋白方法，其脱色的最佳工艺条件为：聚酰胺用量为50 g，聚酰胺柱用1.5倍柱体积的去离子水以1.5 mL/min的流速进行洗脱，在此工艺条件下，蛋白质脱除率达到94.2%。金针菇下脚料多糖对黑曲霉和酿酒酵母没有抑菌活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有一定的抑菌作用，最小抑菌浓度分别为2.25、5、2.25 mg/mL，且抑菌活性与多糖质量浓度呈正相关关系。

金针菇下脚料多糖；聚酰胺层析；脱色；抑菌

金针菇（Flammulina velutipes）又名朴菇、冬菇，隶属真菌门，担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，口磨科，金钱菌属，目前已发展成为世界第三大食用菌[1]。研究表明金针菇多糖具有增强免疫力[2-3]、改善记忆[4]、护肝[5-6]、抗肿瘤[7-8]等功效。金针菇加工过程中会产生菌柄、菌盖、畸形菇等下脚料，大多未经处理而直接丢弃，既污染环境又造成极大的浪费[9]，目前关于金针菇下脚料多糖（Polysaccharides from Flammulina velutipes scraps，FVSP）的提取大多采用水浴法和微波辅助提取法[10]，在多糖提取过程中，提取物中会含有较多的蛋白质和色素，对金针菇下脚料多糖脱色和脱蛋白是其精制过程中非常重要的一步，是研究其理化性质、生物活性和化学结构的基础。

为了获得纯度较高的金针菇下脚料多糖，以金针菇下脚料为原料，探讨金针菇下脚料多糖的聚酰胺层析脱色工艺，另外关于金针菇下脚料多糖的抑菌活性研究还鲜见报道，所以在金针菇下脚料多糖脱色的基础上，进一步探讨其抑菌活性，旨在为开发金针菇下脚料多糖天然防腐剂提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

金针菇下脚料：张家港市常兴菌业有限公司提供；聚酰胺：中国医药集团上海化学试剂公司；DPPH：上海华蓝化学科技有限公司；水杨酸、浓硫酸、95%乙醇、硫酸亚铁、双氧水、盐酸、Tris-HCl缓冲溶液（50 mmol/L，pH8.2）、邻苯三酚、正丁醇、三氯甲烷、葡萄糖、苯酚等均为分析纯；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、黑曲霉（Aspergillus niger）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：常熟理工学院微生物实验室提供；细菌培养基、霉菌马铃薯培养基（PDA培养基）、酵母培养基（YPD培养基），参照文献配制[11]。

1.2主要仪器

RE－52A型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器公司；DJ-04粉碎机：上海淀久中药机械制造有限公司；TU-1091型紫外分光光度计：北京普析通用仪器责任有限公司；LD4-ZA型离心机：北京医用离心机厂；SHB-B循环水式真空泵：郑州长城科工贸公司；LGJ-10冷冻干燥仪：南京百思威科技有限公司；UV2102 PCS紫外扫描仪：上海精密仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1金针菇下脚料的预处理

金针菇下脚料在50℃条件下真空干燥后粉碎，过80目筛，得到预处理的金针菇下脚料粉。

1.3.2金针菇下脚料多糖的提取

称取金针菇下脚料粉10 g，放入烧杯中，然后加入300 mL水，在80℃条件下提取3 h，然后冷却，将提取液离心（4 000 r/min）15 min，弃去沉淀，将上清液减压浓缩，按体积比1∶4加入95%乙醇，4℃条件下过夜，弃去上层液体，将沉淀冷冻干燥得到金针菇下脚料多糖。

1.3.3蛋白质含量测定

福林-酚法[12]。

1.3.4多糖含量测定

苯酚-硫酸法[13]。

1.3.5金针菇下脚料多糖中蛋白的脱除

1.3.5.1Sevage法

称取20 mg金针菇下脚料多糖，加入蒸馏水配制成10%的多糖溶液，按照金针菇下脚料多糖溶液的1/ 4体积加入Sevage试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1），在25℃下混合振荡40 min，然后离心（1 000 r/min，15 min）去沉淀，将上清液再按上述比例加入Sevage试剂，重复操作6次，测定上清液中的蛋白质含量和多糖含量，根据公式（1）和（2）计算多糖保留率和蛋白质脱除率。

1.3.5.2三氯乙酸法

称取20 mg金针菇下脚料多糖，加入蒸馏水配制成10%的多糖溶液，然后向多糖溶液加入三氯醋酸（3%），直至溶液不再继续浑浊为止，4℃条件下放置过夜，然后离心（1 000 r/min，15 min），弃去沉淀，测定上清液中的蛋白质和多糖含量，根据公式（1）和（2）计算多糖保留率和蛋白质脱除率。

1.3.5.3聚酰胺层析法

称取50 g聚酰胺，倒入一定量的去离子水中加热15 min，然后装层析柱（4 cm×58 cm），最后用去离子水洗脱平衡，然后称取20mg金针菇下脚料多糖，加入去离子水配制成10%的多糖溶液，将多糖溶液上柱，用去离子水洗脱，测定洗脱液中的蛋白质含量和多糖含量，根据公式（1）和（2）计算多糖保留率和蛋白质的脱除率。

1.3.6金针菇下脚料多糖聚酰胺层析脱色条件的优化1.3.6.1去离子水用量对脱色效果的影响

称取40 mg金针菇下脚料多糖，加入去离子水配制成10%的多糖溶液，然后添加到40 g的聚酰胺柱（40 mm×580 mm）中进行吸附，用0.5、1、1.5、2、2.5倍柱体积的去离子水以1.0 mL/min的流速进行洗脱，359 nm处测定多糖原液和洗脱液吸光值计算脱色率，根据下面公式（3）计算脱色率[14]，苯酚-硫酸法检测多糖，根据公式（1）计算多糖保留率，探讨去离子水用量对脱色效果的影响。

1.3.6.2聚酰胺用量对脱色效果的影响

称取40 mg金针菇下脚料多糖，加入去离子水配制成10%的多糖溶液，然后分别将10、30、50、70、90 g的聚酰胺倒入一定量的去离子水中加热10 min，分别装层析柱（4 cm×58 cm），去离子水洗脱平衡。分别将多糖溶液加入聚酰胺层析柱中进行吸附，1倍柱体积的去离子水以1.0 mL/min的流速进行洗脱，分别计算脱色率和多糖保留率，探讨去聚酰胺水用量对脱色效果的影响。

1.3.6.3洗脱速度对脱色效果的影响

不清楚。云梦说，她刚刚大学毕业，想在这里找一份工作……可是工作哪有这么好找？何况她眼高手低。所以我想，少则一两个月，多则一年半载吧！

称取40 mg金针菇下脚料多糖，加入去离子水配制成10%的多糖溶液，然后添加到40 g的聚酰胺柱（40 mm×580 mm）中进行吸附，以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min的流速进行洗脱，分别计算脱色率和多糖保留率，探讨洗脱速度对脱色效果的影响。

1.3.7紫外光谱检测

称取40 mg金针菇下脚料多糖，加入去离子水配制成10%的多糖溶液，在聚酰胺层析脱色最佳条件下，将金针菇下脚料多糖溶液上聚酰胺色谱柱，蒸馏水进行洗脱，紫外光谱对洗脱液进行扫描（波长范围：190 nm～800 nm），来探讨聚酰胺层析对金针菇下脚料多糖中蛋白质的去除效果，根据公式（2）计算蛋白质脱除率。

1.3.8金针菇下脚料多糖的抑菌活性

1.3.8.1菌种活化与菌悬液制备[15]

将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌接种到细菌培养基中，置于37℃恒温振荡培养24 h；将黑曲霉和酿酒酵母分别接种到PDA培养基和YPD培养基中，28℃下培养48 h，长出菌落后，分别挑取活化后的菌种放入9 mL无菌生理盐水中，振荡摇匀制备菌悬液，浓度约为106CFU/mL～108CFU/mL备用。

1.3.8.2抑菌试验

用无菌水配制成质量浓度为100 mg/mL的金针菇下脚料多糖溶液。分别稀释成40、20、10、5、2.25 mg/mL系列质量浓度溶液。取供试菌悬液0.1 mL（浓度约为106CFU/mL）置于倒好培养基的培养皿中，放入牛津杯，向牛津杯中加入不同质量浓度的多糖溶液200μL，每个质量浓度做3次重复，同时用无菌水做对照。细菌于37℃培养48 h，真菌于28℃培养72 h，用游标卡尺测定抑菌圈直径，出现抑菌圈所对应的金针菇下脚料多糖浓度即为最小抑菌圈浓度。

2　结果与讨论

采用三氯乙酸法、Sevage法和聚酰胺吸附柱层析法对金针菇下脚料多糖中的蛋白脱除效果见图1。

从图1可以看出，三氯乙酸法蛋白脱除率和多糖保留率都较低，易引起多糖的降解。Sevage法脱除蛋白次数较多（6次），导致多糖损失较多，聚酰胺吸附柱层析法具有较好的脱除蛋白的效果，蛋白脱除率达91.9%，且对多糖影响较小，多糖保留率较高，达到86.9%，所以选择聚酰胺吸附柱层析法作为金针菇下脚料多糖脱蛋白的方法。

图1　金针菇下脚料多糖不同脱蛋白方法的比较Fig.1　Comparision ofdeproteinization of FVSP by different methods

2.2金针菇下脚料多糖的脱色

2.2.1去离子水用量对脱色效果的影响

去离子水用量对脱色效果的影响结果见图2。

图2　洗脱体积对金针菇下脚料多糖脱色效果的影响Fig.2　Effect of elution volume on decolorization of PVSP

从图2可知，随着洗脱体积的增加，金针菇下脚料多糖脱色率逐步下降，但是多糖保留率逐渐增加，当洗脱体积达到1.5倍柱体积时，其脱色率达到48.6%，多糖保留率为88.3%，洗脱体积大于1.5倍柱体积时，多糖保留率变化不大，因此选用1.5倍柱体积的去离子水进行洗脱。

2.2.2聚酰胺用量对脱色效果的影响

聚酰胺用量对金针菇下脚料多糖脱色效果的影响结果见图3。

图3　聚酰胺用量对金针菇下脚料多糖脱色效果的影响Fig.3　Effectof polyamide dosage on decolorization of FVSP

从图3可以看出，随着聚酰胺用量的增加，脱色率逐步增大，多糖的保留率逐渐下降，当聚酰胺用量超过50 g，多糖脱色率变化不大，但多糖的保留率有较大的下降，为了尽可能多地保留多糖，节约处理费用，确定聚酰胺用量为50 g。

2.2.3洗脱速度对脱色效果的影响

洗脱速度对脱色效果的影响结果见图4。

图4　洗脱速度对金针菇下脚料多糖脱色效果的影响Fig.4　Effect of flow rate on decolorization of FVSP

从图4可知，洗脱速度对脱色率没有明显的影响，但是随洗脱速度的增大，多糖的保留率逐渐减小，当洗脱速度小于1.5 mL/min时，多糖的保留率变化不大。由于洗脱速度越小，耗时越长，所以选择的洗脱速度为1.5 mL/min。

通过金针菇下脚料多糖脱色试验，最终确定聚酰胺对金针菇下脚料多糖脱色的最佳工艺条件为：聚酰胺用量为50 g，聚酰胺柱用1.5倍柱体积的去离子水以1.5 mL/min的流速进行洗脱。

2.3紫外光谱

金针菇下脚料多糖脱蛋白前后的紫外光谱图见图5。

图5　金针菇下脚料多糖的紫外光谱图Fig.5　UV spectrum of FVSP

从图5可以看出，金针菇下脚料粗多糖在280 nm处有一个较为明显的吸收峰。在最佳聚酰胺柱层析脱色条件下，经过聚酰胺色谱柱处理之后，这个峰消失，经福林-酚法[12]测定后，蛋白质脱除率达到94.2%。

2.4金针菇下脚料多糖的抑菌活性

金针菇下脚料多糖的抑菌效果见表1。

从表1可以看出，金针菇下脚料多糖对黑曲霉和酿酒酵母没有抑菌活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有一定的抑菌作用，且抑菌活性与多糖质量浓度呈正相关关系，其中对金黄色葡萄球菌抑制作用最强，对大肠杆菌的抑制作用最弱。金针菇下脚料多糖对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为2.25 mg/mL，对大肠杆菌的最小抑菌浓度为5 mg/mL。

表1　金针菇下脚料多糖对各菌种的抑菌效果Table 1　Antimicrobialresults of FVSP againstdifferent microorganisms

3　结论

1）确定聚酰胺吸附柱层析法作为金针菇下脚料多糖脱蛋白的最佳方法。

2）确定聚酰胺柱层析对金针菇下脚料多糖脱色的最佳工艺条件为：聚酰胺用量为50 g，聚酰胺柱用1.5倍柱体积的去离子水以1.5 mL/min的流速进行洗脱，在此条件下，蛋白质脱除率达到94.2%。

3）金针菇下脚料多糖对黑曲霉和酿酒酵母没有抑菌活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有一定的抑菌作用，且抑菌活性与多糖质量浓度呈正相关关系，其中对金黄色葡萄球菌抑制作用最强，对大肠杆菌的抑制作用最弱。金针菇下脚料多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为2.25、5、2.25 mg/mL。

[1] 郑义,李超,王乃馨.金针菇多糖的研究进展[J].食品科学,2010,31 (17):425-428

[2] 朱曙东,严茂祥,陈芝芸,等.金针菇多糖免疫活性的研究[J].浙江中医学院学报,2001,25(4):43-44

[3]常花蕾,雷林生,余传林,等.金针菇多糖对小鼠免疫细胞产生细胞因子及对荷瘤小鼠血清细胞因子含量的影响[J].中药材,2009, 32(4):561-563

[4]潘鸿辉,宇雄涛,黄纪国,等.金针菇多糖改善小鼠学习记忆功能[J].中国食用菌,2014,35(5):40-42

[5]李怡芳,曾怀苇,王敏,等.金针菇多糖对小鼠急性肝损伤的保护作用[J].广东药学院学报,2010,26(2):162-165

[6]PANG Xiubing,YAO Wenbing,YANG Xiaobing.Purification,characterization and biological activity on hepatocytes of a polysaccharide fromFlammulina velutipes mycelium[J].Carbohydrate Polymers, 2007,70(3):291-297

[7]Ohkuma T,Otagiri K,Ikekawa T,et al.Augmentation of antitumor activity by combined cryo-destruction ofsarcoma 180 and proteinbound polysaccharide,EA6,isolated from Flammulina velutipes (Curt.ex Fr.)Sing in ICR mice[J].Journal of Pharmacobio-Dynamics,1983,6(2):96-104

[8]陈芝芸,严茂祥,项柏康.金针菇多糖对Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤作用及免疫功能的影响[J].中国中医药科技,2003,10(4): 226-227

[9] 常明昌.食用菌栽培学[M].北京:中国农业出版社,2003:52

[10]王丽威,郭旭颖,陈梁成,等.水浴法和微波法提取金针菇下脚料多糖的优化及比较研究[J].食品工业科技,2012,33(8):322-325

[11]袁丽红．微生物学实验[M].北京:化学工业出版社,2010:30-33

[12]Lowry O H,Rosebrough N J,Farr A L,etal.Protein measurement with the folin phenolreagent[J].Journalof Biology Chemistry,1951(193): 265-275

[13]Dubois M,Gilles K A,Hamilton J K,et al.Colorimetric method for determination ofsugars and related substances[J].Analytical Chemistry,1956(28):350-356

[14]王维香,王晓君,黄潇,等.川芎多糖脱色方法比较[J].离子交换与吸附,2010,26(1):74-82

[15]李湘利,刘静,燕伟,等.芡实多糖的抗氧化活性及抑菌特性[J].食品与发酵工业，2014，40(11):104-108

Decolorization Technology of Polysaccharides from Flammulina velutipes Scraps and Its Antibacterial Activity

CHEN Yi-yong1，HUANG You-ru1，LIU Jing-jing1，ZHENG Li-xue1，JIHong1，QIU Li-qing1，CAO Ya-jun2
（1.SchoolofBiology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China；2.Zhangjiagang Changxing Edible Fungi Co.，Ltd.，Zhangjiagang 215623，Jiangsu，China）

Flammulina velutipes scraps was used as raw materials.Polysaccharides from Flammulina velutipes scraps（FVSP）were extracted with water.Deprotein rate，polysaccharide retention rate and decoloration rate were used as the index.Decolorization technology of FVSP by polyamide chromatography was investigated.Antibacterial activity of FVSP was also explored.The results showed that polyamide chromatography was the best deproteinization method on FVSP.The optimum decolorization technology was as follows：the content of polyamide was 50 g，and the polyamide column was eluted with 1.5 column volumes of deionized water at flow rate of1.5 mL/min.Under this technology，the deprotein rate was 94.2%.FVSP had no antimicrobialactivity of Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisiae and had antibacterialactivities against Staphylococcus aureus，Escherichia coli and Bacillus subtilis with minimum inhibitory concentration of2.25，5，2.25 mg/mL，respectively．The antibacterialactivity was positively correlated with polysaccharides concentration.

polysaccharides from Flammulina velutipes scraps；polyamide chromatography；decolorization；antibacterial

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.019

2014年度国家星火计划项目（2014GA690011）；张家港市2013年度科技支撑计划（农业）项目（ZKN1304）

陈义勇（1974—），男（汉），副教授，硕士生导师，博士，主要从事食品科学与天然活性成分方面的研究。

2015-04-22