响应面法优化绞股蓝皂苷微波辅助-超声提取工艺

尤秀丽，郑建忠，陈熔，蔡晓丹，李琼，谭昌会（.闽南师范大学化学与环境学院，福建漳州363000；2.福建省现代分离分析科学与技术重点实验室，福建漳州363000）

响应面法优化绞股蓝皂苷微波辅助-超声提取工艺

尤秀丽1，2，郑建忠1，2，陈熔1，蔡晓丹1，李琼1，谭昌会1，2
（1.闽南师范大学化学与环境学院，福建漳州363000；2.福建省现代分离分析科学与技术重点实验室，福建漳州363000）

以绞股蓝为原料，采用微波超声双辅助提取皂苷。在单因素试验的基础上，采用响应面分析法优化提取工艺，建立二次多项数学模型。结果表明，绞股蓝皂苷微波超声双辅助提取的最优工艺参数为：微波功率400 W、超声时间60 min、乙醇浓度80%、超声温度为51℃、微波时间117 s、液料比28∶1（mL/g），此条件下绞股蓝皂苷提取率为7.05%，与预测值的相对误差约为0.57%，试验值与预测值相吻合。

响应面法；微波超声双辅助提取；绞股蓝；皂苷

绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum）又名七叶胆，甘茶蔓，为葫芦科绞股蓝属多年生落叶草质藤本植物，素有“南方人参”和“第二人参”之美称[1]。绞股蓝主要分布在我国秦岭至淮河线以南的亚热带和热带地区[2]，2002年国家卫生部将其列为新资源药食两用，并将其列入保健品名单[3-4]。现代药理学研究表明，绞股蓝皂甙（gypenosides，GPS）是绞股蓝的主要有效成分，其中绞股蓝皂甙Ⅲ、Ⅳ、Ⅷ、Ⅻ分别与人参皂甙Rbl、Rb3、Rd和F2是同一物质，具有广泛的药理作用，一直是绞股蓝研究的热点[5-7]。

近年来，绞股蓝皂苷提取工艺有很多，如水浴法[8]、醇提法[9-11]、微波法[12-13]、酶提法[14]、超声波[15-16]等方法。超声波和微波提取技术又是天然产物提取中的新型技术[17-20]，具有设备简单、操作快捷、适用范围广、提取率高、溶剂用量少、节时、节能、安全污染小等优点。目前鲜见使用响应面法优化微波-超声双辅助技术提取绞股蓝皂苷的相关报道。本文利用响应面法对微波-超声双辅助提取绞股蓝皂苷进行优化，采用回归分析得到绞股蓝皂苷最佳工艺条件，为绞股蓝皂苷的开发应用研究提供理论参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

绞股蓝，购于漳州紫金药店；人参皂苷Rb1（>98% HPLC）分析标准品，上海纯优生物科技有限公司；无水乙醇、无水甲醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸，均为分析纯。

XFB-200药材粉碎机：吉首市中湘制药机械厂；UV-1800 PC紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；P70D20TP-C6（WO）微波炉：广东格兰仕微波炉电器制造有限公司；BS110S电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；WH-200超声波清洗机：济宁万和超声电子设备有限公司。

1.2标准曲线的制备

精确称取人参皂苷Rb1对照品5.0 mg，用甲醇定容至5 mL，制成浓度为1.0 mg/mL的储备液。精密量取储备液20、40、60、80、100、120μL分别置于具塞试管中，水浴中去除甲醇，加入0.2 mL 5%香草醛冰醋酸溶液、0.8 mL高氯酸，混匀后，密置于水浴中加热，取出、冷却，加入5 mL冰醋酸，相应试剂为空白。在550 nm下测定吸光度，以人参皂苷Rb1质量浓度（x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：y= 21.349x-0.034 4，R2=0.999 2。

1.3微波超声提取绞股蓝皂苷

将所购的绞股蓝置于60℃恒温干燥箱中，待烘干后，用药材粉碎机粉碎，过80目筛，得绞股蓝粉末。称取绞股蓝粉末1.000 0 g，置于微波容器内，然后设定一定的微波功率、微波时间，处理后，再加入一定量乙醇溶液作溶剂，置于超声波器中，在一定的超声温度、超声时间、液料比提取。后冷却后过滤提取液，量其体积。取20μL提取液于具塞试管，用85℃水浴挥干提取液，采用香草醛-高氯酸比色法在波长550 nm下测其吸光度，然后由标准曲线计算出待测样品的绞股蓝皂苷提取率。

式中：C为皂苷的浓度，mg/mL；V为提取液总体积，mL；m为绞股蓝的质量，g。

1.4单因素试验设计

以皂苷提取率为指标，准确称取绞股蓝粉末1.000 0 g，选取微波时间、微波功率、料液比、超声时间、超声温度和乙醇浓度作为影响绞股蓝皂苷微波超声双辅助提取的单因素，每组试验重复3次，取其平均值。

1.5响应面试验设计

根据Box-Behnken试验设计原理，选择影响绞股蓝皂苷提取率的3个主要影响因素：微波时间、料液比和超声温度进行响应面组合试验，试验自变量因素编码及水平设计见表1。

表1　Box-Behnken试验自变量因素水平表Table 1　Variables and levels for the Box-Behnken experimental design

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1微波时间对绞股蓝皂苷提取率的影响

当微波功率400 W，乙醇浓度80%，超声温度60℃，超声时间60 min，液料比10∶1（mL/g），考察微波时间30、60、90、120、150 s对皂苷提取率的影响。结果见图1。

图1　微波时间对皂苷提取率的影响Fig.1　Effect of microwave time on the extraction yield ofsaponins

由图1可知，随着微波时间加长，皂苷提取率随之升高，当微波时间大于120 s后，提取率反而下降，可能是因为微波时间加长，有效成分受到破坏，至使提取率下降，因此，微波时间120 s较为适合。

2.1.2微波功率对绞股蓝皂苷提取率的影响

当微波时间120 s，乙醇浓度80%，超声温度60℃，超声时间60 min，液料比10∶1（mL/g），考察微波功率100、150、400、550、700 W对皂苷提取率的影响。结果见图2。

由图2可知，随着微波功率从100 W增加到400 W，皂苷的提取率增加幅度较大，这可能是因为随着微波功率的增大，强大的内压及分子间的摩擦力使绞股蓝细胞破裂，皂苷溶解速度加快，提取率升高；微波功率过大，温度较高，皂苷有效成分易被氧化降解，从而使提取率下降。因此，试验选取较优微波功率为400 W。

图2　微波功率对皂苷提取率的影响Fig.2　Effect ofmicrowave power on the extraction yield of saponins

2.1.3液料比对绞股蓝皂苷提取率的影响

当微波功率400 W，微波时间120 s，乙醇浓度80%，超声温度60℃，超声时间60 min，考察液料比10∶1、20∶1、25∶1、30∶1、40∶1（mL/g）对皂苷提取率的影响。结果见图3。

图3　液料比对皂苷提取率的影响Fig.3　Effectofolid-to-solventratio on the extraction yield of saponins

由图3可以看出，随着液料比增加，皂苷的提取率也随之增大，当液料比大于25∶1（mL/g）时，提取率反而下降，这可能是因为当料液比达到一定的比例，目标成分已提取充分，料液比若继续升高，则对提取率的影响不大，而且溶剂量过大会增加成本及后续液体浓缩的难度，因此，试验选取液料比25∶1（mL/g）较为适合。

2.1.4超声时间对绞股蓝皂苷提取率的影响

当微波功率400 W，微波时间120 s，液料比25∶1（mL/g），乙醇浓度80%，超声温度60℃，考察超声时间30、45、60、75、90 min对皂苷提取率的影响。结果见图4。

由图4可知，随着超声时间的延长，皂苷提取率也随之升高，当超声时间大于60 min后，提取率反而下降，这可能是因为长时间的提取会使皂苷部分降解，因此，选取最佳超声时间为60 min。

图4　超声时间对皂苷提取率的影响Fig.4　Effectofultrasonic treatmenttime on the extraction yield of saponins

2.1.5超声温度对绞股蓝皂苷提取率的影响

当微波功率400 W，微波时间120 s，超声时间60 min，液料比25∶1（mL/g），乙醇浓度80%，考察超声温度40、50、60、70℃对皂苷提取率的影响。试验结果见图5。

图5　超声温度对皂苷提取率的影响Fig.5　Effect of ultrasonic treatment temperature on the extraction yield of saponins

从图5可见，绞股蓝皂苷随温度的升高而提取率增大，当超声温度为50℃时，绞股蓝总皂苷的提取率达到最大值；提取温度大于50℃后，绞股蓝皂苷的提取率开始下降。其原因是随着温度升高，加快分子运动速度，从而使溶出物增多、皂苷释放加快，提取率增大；若是超声温度过高，杂质溶出增加，有效成分被破坏，而使提取率下降。因此，选定50℃为最佳超声温度，提取率达6.91%。

2.1.6乙醇浓度对绞股蓝皂苷提取率的影响

当微波功率400 W，微波时间120 s，超声温度50℃，超声时间60 min，液料比25∶1（mL/g），考察乙醇浓度60%、70%、80%、90%、100%对皂苷提取率的影响。结果见图6。

从图6可以看出，皂苷的提取率随乙醇浓度的增大而增加，当乙醇浓度为80%时提取率达到最大，这可能是因为绞股蓝中皂苷的极性更接近浓度为80%的乙醇的极性。因此，试验选取乙醇的最佳浓度为80%。

图6　乙醇浓度对皂苷提取率的影响Fig.6　Effectofethanolconcentration on the extraction yield of saponins

2.2响应面法试验结果与分析

利用Design Expert7.0软件中的Box-Behnken设计[21]的试验条件及试验结果见表2。

对表2中试验数据进行回归分析，得到回归方程为：Y=6.87-0.055A+0.33B+0.093C+0.040AB+0.23AC+ 0.23BC-0.57A2-0.42B2-1.61C2。再对该模型进行响应面分析，得出二次响应回归模型的方差分析结果见表3。

表3　二次响应模型方差分析Table 3　ANOVA results of the fitted quadratic regression model

续表3　二次响应模型方差分析Continue table 3　ANOVA results ofthe fitted quadratic regression model

由表3的ANOVA方差分析可知，模型的P值< 0.01，差异极显著，说明回归模型拟合程度较好，试验误差小，可以用该模型对乙醇微波超声双辅助提取绞股蓝皂苷的提取率进行分析和预测。从F值可知，各因素对绞股蓝皂苷提取率的影响顺序为：B>C>A，即液料比﹥超声温度>微波时间；一次项B和C显著，二次项A2、B2和C2极显著，交互项AC、BC显著，AB不显著，说明二次项响应值对试验结果影响很大，不是简单的一次线性关系。

对表3的分析结果作回归优化响应曲面，见图7。

图7　AB、AC和BC分别对皂苷提取率影响的响应面Fig.7　The response surface of AB、AC and BC on extraction yield ofchlorogenic acid

表2　RSM试验设计与结果Table 2　Experimentaldesign and corresponding results for RSM

由图7可知，响应面都是开口朝下的抛物曲面，其中心位于试验考察的区域范围内，说明在试验单位内所考察指标存在最大值。

利用Design Expert 7.0软件进行工艺参数的优化组合，可得绞股蓝皂苷提取的最佳工艺条件为微波时间117.12 s、液料比27.75∶1（mL/g）、超声温度51.24℃，在该条件下绞股蓝皂苷提取率预测值为7.01%。

为了检验响应面法的可靠性，在上述最佳工艺条件进行绞股蓝中皂苷微波超声双辅助提取的试验，平行3次，同时考虑实际操作情况，将绞股蓝皂苷最佳工艺条件修正为：微波时间117 s、液料比28∶1（mL/g）、超声温度51℃，实际得到绞股蓝皂苷提取率的平均值为7.05%，与预测值基本吻合，其相对误差约为0.57%。从而证实该模型可用于绞股蓝皂苷的提取。与其他方法相比，微波超声双辅助提取绞股蓝皂苷的提取率较高，提取时间较短。

3　结论

以绞股蓝为原料，采用微波超声双辅助提取皂苷，通过单因素和Box-Behnken响应面法试验得到优化的工艺参数：微波时间117 s、液料比28∶1（mL/g）、超声温度51℃、乙醇浓度80%、超声温度为60℃、超声时间60 min，在该条件下验证绞股蓝皂苷提取率的平均值为7.05%，与预测值基本吻合，说明此模型用于绞股蓝皂苷的提取工艺是可行的。绞股蓝皂苷提取工艺经优化后提取率得到有效提高，可再为绞股蓝的再利用提供参考。

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Optimization of Microwave-ultrasonic-assisted Extraction of Saponins from Gynostemma
pentaphyllum Using Response Surface Methodology

YOU Xiu-li1，2，ZHENG Jian-zhong1，2，CHEN Rong1，CAIXiao-dan1，LIQiong1，TAN Chang-hui1，2
（1.Colllege of Chemistry and Environment，Minnan Normal University，Zhangzhou 363000，Fujian，China；2.Fujian Province Key Laboratory of Morden Analytical Science and Separation Technology，Zhangzhou 363000，Fujian，China）

The microwave-ultrasonic-assisted extraction ofsaponins from Gynostemma pentaphyllum was optimized using response surface methodology.Base on single-factor experiments，the extraction conditions ofmicrowave-ultrasonic-assisted extraction yield of saponins in the Gynostemma pentaphyllum were by RSM.As a result，a quadratic polynomial mathematical model was built.The optimal extraction conditions of RSM were determined as follows：Gynostemma pentaphyllum were suspended in microwave power of 400 W，subjected to ultrasonic treatment for 60 min at temperature of 51℃，80% ethanol concentration at solvent-to-solid ratio 28∶1（mL/g）and then microwaves 117 s.The resultofverification experiment（7.05%）was coincided with predictive value.

response surface methodology；microwave-ultrasonic-assisted extraction；Gynostemma pentaphyllum；saponins

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.012

福建省教育厅科技项目（JA12218）；福建省教育厅科技项目（JA15310）

尤秀丽（1978—），女（汉），副教授，硕士，主要从事天然产物的提取、手性识别机理研究。

2015-01-19