石榴皮总多酚的微波辅助提取工艺及抗氧化活性研究

黄琦，王启越，李颖，叶春林（.浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江杭州30023；2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，浙江杭州30023）

石榴皮总多酚的微波辅助提取工艺及抗氧化活性研究

黄琦1，2，王启越1，李颖1，叶春林1，2
（1.浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江杭州310023；2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，浙江杭州310023）

利用响应面分析法优化石榴皮总多酚的微波辅助提取工艺，以总多酚得率为指标，通过单因素试验及响应面分析，研究了乙醇体积分数、提取时间、提取功率和液固比4个主要因素对石榴皮总多酚得率的影响。采用Box-Benhnken中心组合设计和响应面分析法，建立了回归方程的预测模型，确定最佳提取条件为乙醇体积分数58%、提取时间98 s、提取功率235 W、液固比49∶1（mL/g）。此条件下总多酚得率为（23.26±0.15）%。试验结果与模型预测值基本相符。用红外光谱对总多酚提取物进行了表征。石榴皮总多酚对DPPH自由基的半清除质量浓度为0.28 mg/mL，具有较强的抗氧化作用。

石榴皮；总多酚；响应面分析法；微波辅助提取；抗氧化活性

石榴皮是《中国药典》收载的一种中草药[1]，Saito 等[2]研究发现石榴皮提取物的抗氧化能力在日本上千种药用植物中位列第一，且其抗氧化活性与多酚含量相关。石榴皮总多酚不仅具有较强的抗氧化性，还有抗菌、消炎、驱虫、涩肠、止血等功效，具有广阔的开发价值和应用前景。石榴皮总多酚大多以苯环的多羟基取代为特征，主要包括黄酮类、鞣质类和有机酸类化合物[3-4]。本研究利用响应面法对微波辅助提取石榴皮中总多酚的工艺进行优化，先采用单因素试验分析乙醇体积分数、提取时间、液固比和提取功率对总多酚得率的影响，再通过响应面优化得出最佳提取条件，并对提取的总多酚进行红外光谱结构表征。通过石榴皮总多酚对DPPH自由基的清除作用测定其抗氧化活性，以期为石榴皮的深入开发与应用提供试验和理论依据。

1　材料和方法

1.1材料与试剂

陕西石榴皮叶烘干、粉碎，过60目筛，置阴凉干燥处备用。DPPH自由基、维生素C（VC）：美国sigma公司；福林酚试剂：北京奥博星生物技术有限责任公司；没食子酸（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、碳酸钠（分析纯）：上海国药集团化学试剂有限公司；试验用水为蒸馏水。

1.2主要仪器设备

WGD2S.01型微波设备：南京三乐微波技术发展有限公司；DFY-500摇摆式高速中药粉碎机：温岭市大德中药器械有限公司；低速离心机：江苏天力医疗器械有限公司；752紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；BSA224S万分之一电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；DKS-24型电热恒温水浴锅：杭州蓝天化验仪器厂。

1.3方法

1.3.1标准曲线的绘制

精密称取10 mg已干燥至恒重的没食子酸标准品，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，即得100μg/mL的没食子酸标准溶液，备用。分别精确量取没食子酸标准品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，分别置于25 mL的具塞容量瓶中，采用福林法参照文献[5]方法测定吸光度，以吸光度A为纵坐标、没食子酸的浓度C（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.2石榴皮总多酚的提取和测定

准确称取0.4 g石榴皮粉末，加一定体积的乙醇-水溶液，在特定的微波功率下提取，然后迅速冷却，4 000 r/min离心15 min，残渣按上述条件重复提取1次，合并上清液，用提取溶剂定容至50 mL。

1.3.3石榴皮总多酚得率

准确移取待测液0.1mL，置于25 mL的具塞试管中，参照1.3.1方法测定总多酚吸光度，代入回归方程，按没食子酸当量计算总多酚含量。总多酚得率/%=提取液中总多酚质量/原料质量×100。

1.3.4单因素试验

石榴皮粉末过60目筛后，考察乙醇体积分数、提取时间、液固比和提取功率对总多酚得率的影响。

1.3.5响应面优化分析石榴皮总多酚提取工艺

采用Design-Expert8.0.6软件处理数据，根据单因素试验结果，以总多酚得率为响应值，设计四因素三水平的响应面分析试验。

1.3.6石榴皮中总多酚的红外光谱表征

上述总多酚提取物烘干、KBr压片，在波数400 cm-1～4 000 cm-1处扫描。

1.3.7对DPPH自由基的清除作用

参考Ye等[6]的方法测定，以VC为参比，测定石榴皮总多酚提取物对DPPH自由基的清除作用。

2　结果与分析

2.1标准曲线的绘制

按1.3.1方法得到总多酚标准曲线的线性回归方程为：A=0.110 7C+0.009 1，相关系数r=0.999 2。

2.2单因素试验

随着我国社会经济的不断发展，道路交通建设实现了高速发展，同时随着人们生活水平和人均收入的不断提高，购买私家车的家庭也逐年增多。私家车数量上的增多一方面给人们的生活带来了极大的便利，另一方面增加了城市交通管理的复杂性，交通事故出现的概率较往年而言也有了大幅度的增加，其中酒驾事故的频频发生，不仅给自身而且也给社会安全带来了极大危险，由此，人们对于该方面的立法也给予了足够的关注和认识。

2.2.1乙醇体积分数对总多酚得率的影响

在提取时间60 s，液固比30∶1（mL/g），微波功率200 W条件下，用不同体积分数的乙醇（30%、40%、50%、60%、70%）提取石榴皮总多酚，结果见图1。

图1　乙醇体积分数对总多酚得率的影响Fig.1　Effects ofethanolconcentration on extraction yield of total polyphenols

从图1可知，乙醇体积分数对石榴皮总多酚得率有较大影响，当乙醇体积分数达到60%时，总多酚得率最高，随后有所下降。根据相似相溶原理，可能是总多酚极性与60%的乙醇溶液的极性相似。另外，乙醇体积分数过高，脂溶性物质溶出也增加，干扰因素也随之增大。

2.2.2微波提取时间对总多酚得率的影响

在液固比30∶1（mL/g），微波功率200 W，乙醇体积分数的60%的条件下，改变提取时间（30、60、90、120、150 s）提取石榴皮总多酚，结果见图2。

图2　提取时间对总多酚得率的影响Fig.2　Effects ofextraction time on extraction yield of total polyphenols

从图2可知，提取时间对总多酚得率的影响呈先上升后下降的趋势，90 s附近时总多酚得率达到最大。当提取时间较短时，石榴皮总多酚浸出太少；提取时间过长时，可能是由于温度的升高导致总多酚不稳定而被破坏分解，从而使得率略有下降趋势。

2.2.3微波提取功率对总多酚得率的影响

在液固比30∶1（mL/g），乙醇体积分数的60%，提取时间60 s的条件下，改变微波提取功率（100、200、300、400、500、600 W）提取石榴皮总多酚，结果见图3。

图3　提取功率对总多酚得率的影响Fig.3　Effects ofe the microwave power on extraction yield of total polyphenols

2.2.4液固比对总多酚得率的影响

在乙醇体积分数的60%，提取时间60s，微波提取功率200W的条件下，改变液固比 [10∶1、20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1（mL/g）]提取石榴皮总多酚，结果见图4。

图4　液固比对得率的影响Fig.4　Effects of liquid-solid ratio on extraction yield of total polyphenols

从图4可知，液固比对石榴皮总多酚的提取得率有影响，提取得率随液固比增加而增大，其中30∶1（mL/g）之后的增长率变得缓慢。浓度差所产生的渗透压力是植物细胞组织与提取溶剂之间相平衡过程的主要推动力，而液固比反映了浓度差，浓度差越大，扩散推动力就越大，从而有利于提高浸取效率。但是过高的液固比，并不会明显提高提取效果，并且会消耗大量的溶剂。

2.3石榴皮总多酚提取的响应面优化分析

2.3.1模型的建立及显著性检验

根据Box-Benhnken的中心组合试验设计，以总多酚得率为目标函数，综合2.2单因素试验结果，选取乙醇体积分数（A）、微波提取时间（B）、微波提取功率（C）和液固比（D）为试验因素，设计四因素三水平的响应面分析试验。响应面因素水平见表1，设计方案与结果见表2，回归二次方程的方差显著性检验分析结果见表3。

表1　响应面试验设计因素和水平Table 1　Experimentalfactors and levels in response surface design

表2　响应面试验设计与结果Table 2　Arrangement and experimentalresults ofresponse surface design

表3　响应面分析法对总多酚得率的方差分析Table 3　Analysis ofvariance ofthe constructed regression model

采用Design-Expert8.0.6软件对试验结果建立二次响应面回归模型，以石榴皮总多酚得率为响应值的回归方程为：得率＝-11.505 08＋0.712 75A＋0.089 494B+ 0.057 090C+0.100 70D－2.083 33×10-4AB－5.8×10-4AC＋2.45×10-3AD＋8×10-5BC＋1.4×10-3BD－3.375×10-4CD－5.860 83×10-3A2－8.456 48×10-4B2－3.085 83×10-5C2－2.785 83×10-3D2。

由表3可知，以石榴皮中总多酚得率为响应值时，回归方程显著性检验P<0.000 1，表明该二次方程模型极显著；同时，失拟项P=0.142 5>0.100 0，不显著，表明试验结果和数学模型拟合度良好，即可用该数学模型推测试验结果[7]。模型的R2=0.946 1，说明响应值的94.61%是由于所选变量引起，表明该方程具有较好的拟合相关性，可以用该回归方程确定最佳提取工艺[8-9]。另外，所建模型的变异系数（C.V.）为0.99%，表明模型重复性良好[10]。通过模型的回归方差分析（表3）可以看出，4个因素对得率的影响都是极显著的（P<0.01），交互相AC、BD、CD对试验结果的影响也是极显著的（P< 0.01），交互相AD、BC（P<0.05）对试验结果影响显著。

2.3.2提取工艺的响应面交互作用分析与优化

各因素之间的交互作用绘制响应面曲线图，见图5～图10。

图5　乙醇体积分数和提取时间对总多酚得率的响应面和等高线Fig.5　Response surface and contour line of ethanolconcentration and extraction time

图6　乙醇体积分数和提取功率对总多酚得率的响应面和等高线Fig.6　Response surface and contour line of ethanolconcentration and extraction power

图7　乙醇体积分数和液固比对总多酚得率的响应面和等高线Fig.7　Response surface and contour line of ethanolconcentration and liquid-solid ratio

图8　提取时间和提取功率对总多酚得率的响应面和等高线Fig.8　Response surface and contour line ofextraction time and extraction power

图9　提取时间和液固比对总多酚得率的响应面和等高线Fig.9　Response surface and contour line ofextraction time and liquid-solid ratio

图10　提取功率和液固比对总多酚得率的响应面和等高线Fig.10　Response surface and contour line ofextraction power and liquid-solid ratio

等高线图可反映出2个变量间交互作用的显著程度，等高线图的圆心越接近椭圆表示交互作用越强，等高线的稀疏表示响应面图形的平陡[11]。由图5可见，乙醇体积分数和提取时间等高线图的圆心趋于圆形，两因素交互作用不显著，而图6～图10所示的两因素交互作用较显著。由图5～图7可见，总多酚得率随乙醇体积分数增大而升高，但升高到一定程度以后，略有下降，根据相似相溶的原理，最佳的乙醇浓度是由石榴皮总多酚的极性决定的。由图5、图8和图9可见，总多酚得率随着提取时间的增大先增大后减小，根据提取动力学理论，提取时间的延长有助于总多酚的充分扩散析出，但过长的提取时间会加剧总多酚在较高温度环境中的破坏，从而影响了总多酚的得率。由图6、图8和图10可见，总多酚得率随着提取功率的增大而增加，但升高到一定程度以后，趋于平缓，因为提取功率增大使得温度升高，提取的总多酚增多的同时使得一部分对热不稳定的成分被破坏，从而影响了得率。由图7、图9和图10可见，总多酚得率随液固比的增大先增大，后趋于平稳略有减小。

通过Design-Expert 8.0.6软件分析，在选取的4个因素试验水平范围内，得出石榴皮总多酚的理论最佳微波辅助提取工艺条件为：乙醇体积分数58%、提取时间98 s、提取功率235 W、液固比49∶1（mL/g）。在此提取工艺条件下连续进行3次石榴皮总多酚的提取试验，测得平均得率为（23.26±0.15）%，与预测得率23.30%接近，说明该模型与实际情况拟合性良好。

2.4红外光谱分析

提取物红外光谱扫描见图11。

图11　总多酚样品的红外光谱图Fig.11　IR spectrogram for sample

由图11可知，3 368.07 cm-1处有强宽的吸收峰对应O-H伸缩振动；1 702.82、1621.44 cm-1对应羰基吸收峰，1 521.05、1 483.97 cm-1处的吸收峰对应芳环上的骨架振动；1 406.08、1 334.42 cm-1处的吸收峰对应次甲基面内弯曲振动，1 300 cm-1～1 000 cm-1有C-O的伸缩振动峰，900 cm-1～650 cm-1有多个吸收峰，说明苯环上有多个取代结构。红外光谱特征和文献[12]报道多酚类化合物红外光谱特征一致，可确认化学组成为多酚类物质。

2.5对DPPH自由基的清除作用测定

石榴皮总多酚提取物和VC对DPPH自由基清除作用见图12。

由图12可见，随着石榴皮总多酚提取物的浓度增加，对DPPH自由基清除能力也增大。总多酚提取物和VC的半清除质量浓度（IC50）分别为0.28 mg/mL 和0.26 mg/mL，两者对DPPH自由基清除能力相近。

3　结论

微波辅助提取石榴皮总多酚的最佳提取工艺：以石榴皮粉末为原料，乙醇体积分数58%、提取时间98 s、提取功率235 W、液固比49∶1（mL/g）。此条件下的平均得率为（23.26±0.15）%，与预测值相符，可用于微波辅助提取石榴皮总多酚得率的预测和分析。利用红外光谱对石榴皮总多酚进行结构表征，符合多酚类化合物红外光谱特征。提取物对DPPH自由基清除作用的IC50为0.28 mg/mL，说明石榴皮总多酚具有较强的抗氧化能力。石榴皮总多酚的深入开发和利用有待进一步研究。

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Study on Microwave Assisted Extraction and Antioxidant Activity of Total Polyphenols from Pomegranate Rind

HUANG Qi1，2，WANG Qi-yue1，LIYing1，YE Chun-lin1，2
（1.School of Biologicaland Chemical Engineering，Zhejiang University of Science and Technology，Hangzhou 310023，Zhejiang，China；2.Zhejiang Provincial Key Laboratory for Chemicaland Biological Processing Technology ofFarm Products，Hangzhou 310023，Zhejiang，China）

Response surface method was used to optimize the technologicalconditions ofmicrowave assisted extracting total polyphenols from pomegranate rind.Extraction yield of polyphenols as an indicator，single factorexperiment and response surface method were used to discuss the influence on extraction yield by the ethanol concentration，extraction time，the microwave power and liquid-solid ratio.The regression equation prediction model was developed by Box-Benhnken center combination design and response surface method.The optimal extract conditions were as follows：ethanol concentration 58%，extracting time 98 s，the microwave power 235 W，liquid-solid ratio 49∶1（mL/g）.Under the condition，the extraction yield of polyphenols was（23.26± 0.15）%.The obtained polyphenols was characterized by IR spectra.The IC50values ofthe obtained extracts against DPPH free radicals was 0.28 mg/mL，suggesting that polyphenols from pomegranate rind had a remarkable antioxidanteffect.

pomegranate rind；totalpolyphenols；response surface method；microwave assisted extraction；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.12.011

国家级大学生创新训练计划项目（201511057011）；浙江省高等学校国内访问学者专业发展项目（2015-58）

黄琦（1980—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：食品、药品质量安全与控制。

2015-06-09