双正交法优化醇洗-水提黑皮鸡枞菌多糖的研究*

孙　凯　郭晓萌　牟德华　李　艳，***（河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄　05008）（河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄　05008）

双正交法优化醇洗-水提黑皮鸡枞菌多糖的研究*

孙凯1**郭晓萌1牟德华1李艳1，2***
1（河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018）
2（河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄050018）

采用双正交法优化黑皮鸡枞菌的多糖提取率，为其深加工和多糖产品的开发奠定基础。首先采用正交试验优化黑皮鸡枞菌多糖提取中的醇洗工艺条件，然后再采用正交试验优化其水提工艺条件。试验结果表明，每1 g黑皮鸡枞菌粉加入25 mL水浸润，并调整乙醇体积浓度为80%，超声30 min，洗涤1次，离心去除上清液后的残渣加50 mL去离子水，在沸水中提取30 min，反复提取3次，测定合并液的多糖含量，最终多糖提取率达到92.21%，该工艺简单，无有机溶剂，适用于工业化生产。

黑皮鸡枞菌；多糖；正交试验；醇洗；水提

大型子实体真菌具有丰富的营养和多种对人体有益的功效成分，传统中医也常将其作为主要或者辅助药材用于治疗疾病和保健养生。食用菌多糖是食用菌中最主要的生物活性成分之一，能起到免疫调节剂的作用，在增强免疫力、降血糖、治疗高血压、治疗肿瘤疾病以及病毒性疾病等方面具有很好的疗效。鸡枞菌（Termitomyces albuminosus） 是一种世界范围内的珍贵食药用菌，也叫伞把菇，白蚁菇，生物学分类地位为真菌界，担子菌门，担子菌纲，伞菌目，口蘑科，鸡枞菌属（Termitomyces）。全世界共有鸡枞菌28种，其中黑皮鸡枞菌品质最佳，以多糖为代表的鸡枞菌生物活性物质具有调节生物反应、抑制癌细胞生长、降低血压和胆固醇的作用。最近几年，我国科研工作者成功将黑皮鸡枞菌实现人工栽培，为生理活性物质提取及产品开发奠定了物质基础。目前已有诸多学者研究黑皮鸡枞菌的栽培技术、固态和液态发酵培养技术，以及皂甙等有效成分的功效，但未见黑皮鸡枞菌多糖提取工艺优化和产品开发的研究报道。本文以人工栽培的黑皮鸡枞菌粉为原料，采用2次正交试验组合优化黑皮鸡枞菌多糖提取的醇洗和水提工艺参数，目的是提高多糖提取率，为黑皮鸡枞菌多糖产品的开发奠定基础。

1　材料和方法

1.1材料与试剂

原料：人工栽培黑皮鸡枞菌粉，由北京金珠满江生物科技有限公司提供。

试剂：浓硫酸、葡萄糖，天津永大化学试剂有限公司；苯酚，天津市博迪化工有限公司；体积浓度95%乙醇，石家庄新宇三阳实业有限公司。

1.2仪器与设备

精密电子天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；电热恒温水浴锅、鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；KQ5200型数控超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司；LXJ-IIB离心机，上海安亭科技仪器厂。

1.3试验方法

1.3.1原料多糖含量的测定

依照农业部标准NYT 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的测定》中的方法测定黑皮鸡枞菌粉原料中的多糖含量，试验时先将原料进行干燥，恒重后测定，所有试验平行测定3组。

1.3.2黑皮鸡枞菌多糖提取工艺流程

鸡枞菌粉→加水浸润→乙醇洗涤→超声处理→水提多糖→提取液浓缩→多糖含量测定

1.3.3正交试验优化多糖提取的醇洗工艺条件

以乙醇体积浓度（%）、超声时间（min）和醇洗次数为变化因素，进行三水平正交优化组合，确定最佳醇洗工艺条件。固定超声功率200 W，水提多糖条件为：1 g菌粉的醇洗沉淀加去离子水50 mL，100℃水浴提取1 h，重复2次，测定合并液的多糖含量，计算多糖提取率。醇洗正交优化试验因素水平见表1。

表1　多糖提取时醇洗工艺正交优化试验因素水平表

1.3.4正交试验优化水提多糖的工艺条件

在正交试验优化醇洗工艺的基础上，对水提多糖步骤进行正交优化。以加水量、水提次数和时间为变化因素，以多糖提取率为评价值，正交优化组合试验的因素水平见表2。

表2　水提鸡枞菌多糖工艺正交优化试验因素水平表

1.3.5多糖提取率的计算

多糖提取率定义为提取液中的多糖质量占原料中多糖质量的百分比。提取液中的多糖质量根据苯酚-硫酸法，在490 nm处测定的黑皮鸡枞菌多糖提取液吸光度与葡萄糖标准曲线计算获得，原料中多糖质量分数依照步骤1.3.1进行测定，多糖提取率的计算公式为：

式中：A——多糖提取率，%；

m——提取得到的多糖质量，g；

M——原料含有的多糖质量，g。

2　结果与分析

2.1原料多糖含量及葡萄糖标准曲线的建立

经检测黑皮鸡枞菌粉中粗多糖的含量为5.63%，比金针菇（4.49%）和双孢菇（4.34%）的粗多糖含量高，但比白灵菇（7.24%）、平菇（8.37%）、香菇（6.79%）和杏鲍菇（6.37%）的低。

用苯酚-硫酸法建立的葡萄糖标准曲线见图1。标准曲线的回归方程为y=6.026 6x-0.001 3，相关系数R2=0.999 7。葡萄糖质量浓度与吸光度值存在良好的线性关系。

图1　葡萄糖标准曲线

2.2正交试验优化多糖提取时的醇洗工艺条件

黑皮鸡枞菌粉中除含有多糖外还含有其他多种杂质，在提取多糖前对原料进行预处理可改善提取效果，方法有脱色、脱脂、微波处理、超微粉碎等，如甲醇脱脂，正丁醇法除蛋白，活性炭吸附脱色等。本研究采用乙醇洗涤工艺，乙醇为非电解质，不会发生电离，采用乙醇处理不改变原料性质，并可溶解原料中的脂质和蛋白质类等非多糖类杂质，有助于黑皮鸡枞菌多糖的溶出，还有研究表明渗入原料中的乙醇在加热后会发生内部的沸腾，从而强化多糖提取的效果，更重要的是乙醇无毒，符合食品安全要求。

超声波法广泛用于辅助有效成分提取，超声波的机械能对细胞壁有破坏作用，能增强细胞内的传质，有利于胞内成分的溶出。考虑到成本和操作的可实现性，选用超声波法辅助醇洗工艺。以乙醇浓度、超声处理时间和洗涤次数为变化因素的三因素三水平醇洗正交试验结果见表3。

从表3中可以看出，多糖提取率最高为90.64%，试验条件是乙醇体积浓度80%，超声时间30 min，洗涤1次。影响黑皮鸡枞菌多糖提取率的因素主次顺序为：醇洗次数＞乙醇体积浓度＞超声时间。乙醇洗涤次数增加，多糖提取率反而降低。黑皮鸡枞菌多糖提取率随乙醇体积浓度的提高而增加。由此确定，黑皮鸡枞菌多糖提取的醇洗工艺步骤最佳条件为：乙醇体积浓度80%，超声时间30 min，洗涤1次，此工艺条件下多糖提取率为90.64%。

表3　多糖提取时醇洗工艺正交优化试验结果表

2.3正交试验优化水提多糖的工艺条件

食用菌多糖提取的方法很多，包括溶剂提取法、酸碱提取法、酶提取法、超临界流体萃取法等，本研究依据黑皮鸡枞菌多糖易溶于热水的原理，采用沸水提取，将加水量、提取次数和提取时间作为影响黑皮鸡枞菌多糖提取的主要因素，进行多糖提取率的评价，正交试验结果见表4。

表4　水提鸡枞菌多糖工艺正交优化试验结果表

从表4结果可以看出，影响黑皮鸡枞菌多糖提取率的因素主次顺序为：水提次数＞加水量＞水提时间。水提次数越多，多糖提取率越高。从极差R值可以看出，加水量和水提时间对黑皮鸡枞菌多糖提取效果的影响程度相似。通过均值K1、K2、K3可以看出最理想的提取条件为加水量50 mL，水提3次，每次水提30 min，此工艺条件下多糖提取率达到92.19%。

综合黑皮鸡枞菌多糖提取的醇洗和水提双正交最佳工艺条件，再进行3次重复试验，得到粗多糖提取平均为92.21%。在此条件下放大到千克以上中试获得同样效果，较相关文献中的多糖提取率有较大程度提高。

3　结论

黑皮鸡枞菌多糖提取的最佳工艺条件为，每1 g黑皮鸡枞菌粉，加25 mL水浸润，调整乙醇体积浓度为80%，进行超声处理30 min，离心弃去上清液回收乙醇，残渣用体积浓度80%乙醇悬浮洗涤离心1次，加水50 mL，沸水提取3次，每次30 min，多糖提取率92.21%。该工艺简单、无有机溶剂残留、符合食品安全要求，适用于工业化生产。

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Optimization ofethanolleaching-water extraction oftermitornyces badius polysaccharides by double orthogonaltest*

SUN Kai1**GUO Xiaomeng1MOU Dehua1LI Yan1，2***
1（College ofbioscience and bioengineering，Hebei universityofscience and technology，Hebei Shijiazhuang 050018，China）
2（R&Dcenter for fermentation engineeringofHebei province，Hebei Shijiazhuang 050018，China）

The double orthogonal test was employed toimprove the extractionrate ofT.badius polysaccharides,and the relatively high extraction rate laid the foundation of deep processing and polysaccharides products development.In this trial,the first orthogonal method was used to optimize ethanol leaching process and the second orthogonal method was used tooptimize water extraction process.Result was that each mushroomsample at 1gwas mixed with distilled water and ethanol（ethanol concentration:80%,total volume:25 mL）and placed it in a ultrasonic cleanerfor 30 min once.The precipitatecollectedbycentrifugationwasextractedwith50mLdistilled water at100℃for 3times（30 min each time）. After extraction,thepolysaccharidescontentofliquid extract was determined and the rate ofT.badiuspolysaccharides was 92.21%.This optimal extraction technology is suitable for industrial production because of its simple and no organic solvent.

termitornyces badius；polysaccharides；orthogonal test；ethanol leaching；water extraction

2016-04-28

TS251.6+7

A

1673-6044（2016）02-0035-04

10.3969/j.issn.1673-6044.2016.02.011

2015年国家级大学生创新创业训练计划项目（2015016）。
**孙凯，男，1994年出生，河北科技大学发酵工程专业，在读硕士研究生。
***李艳，通讯作者，E-mail：lymdh58852@163.com.