超声萃取高效液相色谱法测定指画颜料中的6种防腐剂*

陈德文，侯杨璐，刘宣邑，陈梅兰（.国家日用小商品质量监督检验中心，浙江义乌 3000； .浙江树人大学生物与环境工程学院，杭州 3005）



超声萃取高效液相色谱法测定指画颜料中的6种防腐剂*

陈德文1，侯杨璐2，刘宣邑2，陈梅兰2
（1.国家日用小商品质量监督检验中心，浙江义乌 322000； 2.浙江树人大学生物与环境工程学院，杭州 310015）

建立指画颜料中2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、苯甲酸等6种防腐剂的超声萃取-高效液相色谱的测定方法。经试验确定，萃取溶剂为100%甲醇，萃取时间为10 min，萃取温度为25℃。采用Hypersil ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-水为流动相梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长为245 nm。在0.5～20 mg/L检测范围内6种防腐剂的质量浓度与其色谱峰面积呈良好的线性关系，线性相关系数r≥0.999 2，方法检出限为1.15～1.71 µg/L，测定结果的相对标准偏差为1.54%～3.18%（n=8），加标回收率为84.2%～108.0%。该方法操作简单，灵敏度高，可用于指画颜料中6种防腐剂含量的分析检测。

超声萃取；高效液相色谱法；指画颜料；防腐剂

为了防止指画颜料在生产、使用和保存过程中污染而腐败变质，必需添加一种或多种防腐剂。但过量使用防腐剂可能会导致频繁接触防腐剂的人体产生过敏等反应［1-5］。根据欧盟玩具标准EN 71-7-2014 《指画颜料要求和测试方法》的要求，欧盟允许使用的指画颜料防腐剂物质有43种，且每种防腐剂的添加都有限量要求，其检测方法参照欧盟化妆品指令中有关防腐剂的测试方法，而指令只涉及到苯甲酸、水杨酸、山梨酸、对羟基苯甲酸和丙酸等几种防腐剂的分析方法。

根据现有文献报道，防腐剂的测定方法有胶束电动色谱法、毛细管电泳法和伏安法等新型检测方法，还有薄层色谱法、气相色谱法、吸光光度法、高效液相色谱法［6-12］，如武婷等用反相高效液相色谱法同时测定化妆品中的24种防腐剂［13］。目前我国还没有玩具指画颜料中防腐剂的检测方法，无法满足玩具指画颜料行业健康发展的需求。笔者采用超声萃取法，建立了高效液相色谱法测定玩具指画颜料中2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、苯甲酸、4-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸乙酯、4-羟基苯甲酸丙酯、4-羟基苯甲酸正丁酯等6种防腐剂的检测方法。该方法简单、准确，灵敏度高且成本较低，可用于指画颜料中防腐剂的有效测定。

1　实验部分

1.1主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1200 series型，由高压六通进样阀，在线脱气仪，梯度混合仪和UV-Vis检测器组成，美国安捷伦科技公司；

三频恒温数控超声波清洗器：KQ-300GVD型，昆山市超声仪器有限公司；

台式低速自动平衡离心机：TDZ5-WS型，长沙湘智离心机仪器有限公司；

电子分析天平：BS-224S型，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；

乙腈、甲醇：色谱纯，美国天地TEDIA有限公司；

2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、苯甲酸、4-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸乙酯、4-羟基苯甲酸丙酯、4-羟基苯甲酸正丁酯标准样品：德国Bepure有限公司；

实验用水为超纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm）。

1.2色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，大连依利特仪器公司）；流动相：乙腈-水，梯度洗脱，洗脱程序见表1。流速：1.0 mL/min；进样体积：20 µL；柱温：30℃。

表1　流动相梯度洗脱程序

1.3标准溶液配制

标准储备溶液：1 000 mg/L，准确称取6种防腐剂标准样品各0.050 0 g（精确至0.1 mg），用甲醇溶解并用50 mL容量瓶定容，储存于4℃冰箱中备用；

混合标准工作溶液：分别移取适量上述标准储备溶液，用甲醇稀释至浓度分别为0.5，1.0，5.0，10，20 mg/L的系列混合标准工作溶液。

1.4样品前处理

准确称取8种颜色的指画颜料试样0.1 g，置于10 mL离心管中，并准确加入10.00 mL甲醇，用玻璃棒充分搅拌溶解，在频率为45 kHz，温度为30℃的条件下超声提取10 min，然后以10 000 r/min离心10 min，移取部分溶液过0.45 µm微孔滤膜后进样分析。

2　结果与讨论

2.1样品萃取方法优化

2.1.1提取溶剂

分别采用乙腈和甲醇作为提取溶剂进行试验，结果表明，乙腈作为提取剂时，样品提取液中的杂质较多，从而影响色谱检测效果。用100%的甲醇溶解，离心后的上清液清澈，因此实验采用100%甲醇作为提取溶剂。

2.1.2萃取时间

分别向样品中添加质量浓度为1，0.5，2.5，4，4，4 mg/L的混合标准溶液，考察超声时间为10，15，20，25，30，35，40 min时防腐剂的萃取效率。试验结果表明，萃取时间为10 min时防腐剂的提取效率最优，因此选择萃取时间为10 min。

2.1.3提取温度

分别向样品中添加质量浓度为1，0.5，2.5，4，4，4 mg/L的混合标准溶液，分别考察提取温度为10，15，20，25，30，35，40，45℃时磺胺类药物的萃取效率。结果显示，提取温度为25℃时回收率最优，因此实验选择提取温度为25℃。

2.2色谱条件优化

2.2.1色谱柱

分别考察了依利特Hypersil ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），依 利 特SinoChrom ODSBP（200 mm×4.6 mm，5 μm）和安捷伦TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）3种不同极性色谱柱对防腐剂的分离效果，结果表明，防腐剂在不同极性色谱柱上的分离选择性有一定差异，综合考虑采用Hypersil ODS柱（250 mm×4.6 mm， 5μm）进行样品分离。

2.2.2流动相

分别采用不同比例的甲醇-水、乙腈和磷酸二氢钾作为流动相进行试验。结果表明，采用甲醇-水为流动相时，防腐剂不能较好地分离；用乙腈和磷酸二氢钾为流动相时，因为有盐类的存在，很容易把柱子或者管路堵住，导致压力降低无法继续实验；改用乙腈-水作为流动相进行梯度洗脱时，能获得理想的色谱峰形和分离效果，因此实验选择乙腈-水作为流动相。

2.2.3流动相流速

考察了流动相流速为0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2 mL/min时，6种防腐剂的分离效果。试验结果表明，流速过高时峰形过于拥挤，不利于分离；而流速过低时，分析时间延长，峰形变差，最终选择流动相流速为1.0 mL/min。

2.3方法线性范围及检出限

在1.2色谱条件下，将0.5，1，5，10，20 mg/L混合标准工作溶液按浓度由低到高的顺序依次上机进行测定，以待测物质的质量浓度（X ）为横坐标，以峰面积（Y ）为纵坐标，绘制工作曲线。工作曲线方程，相关系数见表2。10 mg/L的混合标准工作溶液色谱图见图1。

以3倍信噪比（S/N=3）计算方法检出限，检出限结果列于表2。

表2　工作曲线方程、相关系数及检出限

图1　混合标准溶液的色谱图

2.4精密度试验

对添加1.00 mg/L标准溶液的试样溶液重复进样8次，结果见表3。由表3可知，测定结果的相对标准偏差为1.54%～3.18%，，说明方法的精密度良好。

表3　精密度试验结果

2.5样品测定及回收试验

取适量8种颜色的指画颜料置于10 mL离心管中，用100%甲醇溶解后超声提取，将提取液离心10 min后用0.45 µm微孔滤膜过膜后进样分析。另取8种颜色的指画颜料各3份，分别加入10，5，25，40，40，40 μL的2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、苯甲酸、4-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸乙酯、4-羟基苯甲酸丙酯、4-羟基苯甲酸正丁酯标准溶液，按样品提取方法提取后，在优化的色谱条件下进样分析，试验结果及加标回收率见表4。由表4可知，样品加标回收率为84.2%～108.0%，可见所建方法的准确度较高。

表4　加标回收试验结果（n=3）

3　结语

建立超声萃取-高效液相色谱法测定指画颜料中防腐剂的方法，方法检出限低，重现性好，精密度、准确度满足分析检测要求，该方法可用于指画颜料中防腐剂的有效测定。

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Determination of Six Preservatives in Finger Paints by Ultrasonic Extraction-High Performance Liquid Chromatography

Chen Dewen1， Hou Yanglu2， Liu Xuanyi2， Chen Meilan2
（1. National Center of Quality Supervision and Inspection for Commodity， Yiwu 322000， China；2. College of Biology and Environment Engineering， Zhejiangshuren University， Hangzhou 310015， China）

A method for determination of six preservatives compounds such as 2-methyl-4-isothiazolin-3-one， benzoic acid， etc. in finger paints by ultrasonic extraction-high performance liquid chromatography was developed. The extraction solvent was 100% methanol，extraction time was 10 min and extraction temperature was 25℃. The chromatographic separation was carried out on Hypersil ODS column （250 mm×4.6 mm，5 μm）. Mobile phase was acetonitrile-water for gradient elution with flow rate of 1.0 mL/min. The wavelength of UV for the HPLC detection was set at 245 nm. The consentration of six preservatives was linear with its chromatographic peak area in the detection range of 0.5-20 mg/L， the correlation coefficent was not less than 0.999 2. The detection limit of the method was 1.15-1.71 µg/L， the relative standard deviation of detection results was 1.54%-3.18%（n=8）， the addition recoveries were 84.2%-108.0%. The method is simple to operate with higher sensitivity， it is suitable for the determination of six preservatives in finger paints.

ultrasonic extraction； high performance liquid chromatography； finger paints； preservative

O657.7

A

1008-6145（2016）04-0043-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.04.011

*浙江省质量技术监督系统科研计划项目（20150272）

联系人：陈德文；E-mail: 42030692@qq.com

2016-05-6