HPV-16感染对喉咽鳞癌组织及FaDu细胞miRNA表达的影响

路武豪郭文涛冯 龙娄卫华*（ 郑州大学第一附属医院耳鼻喉科，河南 郑州 45005； 广东医科大学基础医学院，广东 东莞 5808； 河南中医学院基础医学院病原生物学与免疫学科，河南 郑州 450008）



HPV-16感染对喉咽鳞癌组织及FaDu细胞miRNA表达的影响

路武豪1郭文涛2冯 龙3娄卫华1*
（1 郑州大学第一附属医院耳鼻喉科，河南 郑州 450052；2 广东医科大学基础医学院，广东 东莞 523808；3 河南中医学院基础医学院病原生物学与免疫学科，河南 郑州 450008）

目的 探讨HPV-16感染对喉咽鳞癌组织及FaFu细胞miRNA表达的调控。方法 收集28例人喉咽鳞癌新鲜组织标本，PCR-反向点杂交法检测标本中HPV DNA的存在情况并进行分型。稳定培养整合HPV-16 E6-E7D的人喉咽鳞癌FaDu细胞，利用qRT-PCR对各组标本及细胞中的miR-363、miR-15a及iR-155的表达水平进行检测。结果 28例喉咽鳞癌标本中HPV阳性者检出7例，其中HPV-18型1例，HPV-52型1例，HPV-16，33混合型1例，HPV-16，52混合型1例。qRT-PCR检测结果显示：HPV-16阳性喉咽鳞癌组织和细胞miR-363 和miR-15a表达均显著上调，而miR-155表达水平均则没有显著变化。结论 HPV-16感染能够影响人喉咽鳞癌组织及FaDu细胞miRNA表达水平。

HPV-16；喉咽鳞癌；FaFu细胞；miRNA；调控

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是常见的头颈部恶性肿瘤之一，病因学调查结果提示大量吸烟、饮酒是主要诱因，但是约有超过20%的此类肿瘤患者无烟酒嗜好，推测发病原因可能与HPV-16感染相关［1］。研究发现，HPV相关的HNSCC具有独特的临床特征，并且生物学行为与HPV阴性的HNSCC相比也存在较大差异，产生这些差异的机制尚待探索［2］。

本研究分别检测了仅感染高危型HPV-16喉咽鳞癌组织miRNAs表达水平；稳定感染HPV-16 E6-E7前后FaDu细胞miRNAs表达水平以及HPV阳性的喉咽鳞癌组织和细胞中miRNAs表达水平，探索HPV-16感染对喉咽鳞癌miRNAs表达的影响。

1　材料与方法

1.1标本采集：标本采集于自2013年7月至2014年6月，在郑州大学第一附属医院咽喉头颈外科接受喉咽鳞癌手术切除的患者。

1.2细胞株：成功整合入HPV-16 E6-E7基因的人喉咽鳞癌FaDu细胞株由本课题组构建。

1.3PCR-反向点杂交法检测标本中HPV DNA并分型：参照AxyPrep公司基因组DNA小量试剂盒说明书提取人喉咽鳞癌组织新鲜冰冻组织DNA。PCR-反向点杂交法检测手术切除的喉咽鳞癌新鲜冰冻组织标本中的HPV并进行分型。

1.4qRT-PCR检测miR-363，miR-15a，miR-155表达：参照Small RNA提取试剂说明书提取细胞Small RNA。应用TaqMan 探针法分别扩增整合入HPV-16 E6-E7基因的FaDu细胞和HPV-16阳性的人喉咽鳞癌新鲜冰冻组织中miR-363，miR-15a，miR-155以及内参照U6。使用ABI 7500 fast PCR仪进行扩增。

1.5统计学分析：采用统计软件包SPSS17.0分析。实验数据用（± s）表示；多组均数间检验采用单因素方差分析；组织标本与细胞株miRNA相对表达量比较采用Wilcoxon Signed Ranks Test分析。

2　结 果

2.128例喉咽鳞癌标本中7例检测出为HPV阳性：单一型别HPV感染共5例：HPV-16型3例，HPV-18型1例，HPV-52型1例；两种型别混合感染共2例：HPV-16，33型和HPV-16，52型。

2.228例喉咽鳞癌患者临床特征：大量吸烟的界定标准：吸烟超过20年且每天吸烟量≥1包；大量饮酒的界定标准：饮酒超过20年且每天≥150 g。临床资料见表1。

2.3qRT-PCR检测miR363、miR15a和miR155表达结果：HPV-16阳性喉咽鳞癌组织中miR-15a、miR-363表达均显著上调，miR-155无明显改变；感染HPV-16 E6-E7的FaDu细胞中miR-15a和miR-363表达均显著上调，miR-155仍然没有显著变化；HPV-16阳性的喉咽鳞癌组织和细胞中发现miR-363、miR-15a和miR-155的表达均无显著差异；HPV-16阴性的喉咽鳞癌组织与FaDu细胞中miR-363、miR-15a和miR-155表达亦无显著性差异。见图1。

图1　HPV+组织/细胞与HPV-组织/细胞miR-363，miR-15a，miR-155相对表达水平比较

3　讨 论

HPV相关的HNSCC呈逐年上升趋势，但由于其预后相对较好，吸引了许多研究者来探索HPV相关的HNSCC的发病机制。micro RNA是近年来研究发现的一种内源性小分子RNA，通过介导目的mRNA降解或抑制其翻译过程，来负调控下游靶基因的表达。研究发现miRNAs与许多疾病密切相关，尤其在肿瘤的发生过程中通常存在着micro RNA的异常表达，既可以发挥癌基因的作用，又可以扮演抑癌基因的角色，发生这些现象的作用机制仍需深入研究［3］。

有研究［4］报道称在HPV阳性的HNSCC细胞中miRNA表达谱发生了明显的改变，并且通过基因芯片技术和qRT-PCR检测出在HPV-16阳性HNSCC细胞中表达上调的有miR-363、miR-33和miR-497；表达下调的有miR-155、miR-181a、miR-29a、miR-181b、miR-218，以miR-155和miR-363改变最为明显。此外，通过将HPV阳性的HNSCC标本与HPV阳性的宫颈癌标本miRNA表达谱进行对比后发现在HPV阳性HNSCC中以miR-15a上调最为明显。本研究结果也发现HPV-16阳性的喉咽鳞癌组织中miR-15a表达水平明显高于HPV阴性者，并且稳定感染HPV-16 E6-E7的FaDu细胞中miR-15a表达也显著高于未感染者。那么作为一种抑癌基因，miR-15a在HPV-16阳性喉咽鳞癌组织中表达如此之高，能否认为是HPV相关HNSCC预后较好的原因之一，为我们进行下一阶段的研究提供了一个重要的线索。

［1］ Ranee Mehra, K. Kian Ang, Barbara Burtness.Management of Human Papillomavirus-Positive and Human Papillomavirus-Negative Head and Neck Cancer［J］.Semin Radiat Oncol,2012,22（2）：194-197.

［2］ 高树峰,张少容,徐莲,等.慢病毒介导的siRNA靶向CD47基因对人喉癌细胞Hep-2增殖、凋亡的影响［J］.解放军医学杂志,2013,38（8）：634-638.

［3］ 李博,马俊,刘丽玉,等.沉寂miR-345表达对胃癌细胞增殖的影响及其机制探讨［J］.中华全科医学,2015,13（7）： 1048-1050.

［4］ Walter V,Yin X,Wilkerson MD,et al.Molecular subtypes in head and neck cancer exhibit distinct patterns of chromosomal gain and loss of canonical cancer genes［J］.PLoS One,2013,8（2）：e56823.

R739.65

B

1671-8194（2016）20-0043-02

河南省科技攻关计划项目（No.112102310679）

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