多主棒孢菌孢子及粗毒素悬液对黄瓜防御酶系活性的影响

高苇++王勇++张春祥

摘 要：本研究探讨侵染黄瓜的多主棒孢菌孢子悬液和粗毒素提取液对黄瓜主要防御酶系活性的影响，从生理生化水平揭示多主棒孢菌毒素在病原致病过程中的作用机理。在室内条件下测定多主棒孢菌孢子及其粗毒素悬液作用后，黄瓜植株体内防御酶系过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性变化。结果表明：多主棒孢菌孢子和毒素悬液处理黄瓜叶片后，黄瓜植株体内POD酶和PPO酶活性呈现先增加后降低的趋势，粗毒素悬液作用下酶活力在24 h时可达到最大值；而在孢子悬浮液作用下酶活力在48 h时达到峰值，随后显著降低，120 h后低于未处理的对照。在病原菌初期诱导作用下，SOD酶活性逐渐升高在72 h时达到最大；毒素接种黄瓜叶片后，SOD酶活性在48 h达到峰值，达到峰值后2个处理的SOD酶活性显著降低但均高于对照。本研究证明多主棒孢菌粗毒素对黄瓜寄主防御酶活性与其病原真菌孢子的作用具有一定相似性，酶活性峰值增加比率相近，前者比后者增加峰出现早，毒素诱导作用后防御酶活性最终高于未接种处理，黄瓜对其侵染的抵抗力得以维持，而在孢子悬液的作用下寄主的抵抗力随着其侵染的扩展而降低。

关键词： 多主棒孢菌；粗毒素；防御酶系；活性

中图分类号： S642.2 文献标识码： A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.08.002

Abstract： The aim of this study is to explore the effects of spores and crude toxins of Corgnespora cassiicola on the activity of defensive enzymes of cucumber. It was revealed that the pathogenic mechanism of crude toxin of Corgnespora cassiicola in physiology and biochemistry level. The effects of spores and crude toxins of Corgnespora cassiicola on the activity of defensive enzymes （POD， PPO and SOD） of cucumber were detected under laboratory conditions. The resulted showed that the activity of POD and PPO enzymes first increased and then decreased. The activity of enzymes reached the maximum within 24 h under infected crude toxin；the activity of enzymes reached the peak value at 48 h after infecting conidia of Corgnespora cassiicola， then the value declined with increasing hours， and at finally it was lower than the treatment without infected. The activity of SOD enzymes reached the peak value at 72 h with infecting conidia of Corgnespora cassiicola， and at 48 h with infecting crude toxin of this pathogen. After this moment the values of SOD enzymes decreased significantly but still were higher than the value in control. The results of the study demonstrated that Corgnespora cassiicola crude toxin had similar effects on the defense-enzyme activity of cucumber as spores of this pathogen did， and changes of activity induced by crude toxin in cucumber seedlings was closely related to induced by spores. The resistant of cucumber was conducted with the crude toxin of Corgnespora cassiicola， but it was significantly decreased under the infection and extension of the spores of this pathogen.

Key words：Corynespora cassiicola；crude toxin；defensive enzymes； activity

黄瓜棒孢叶斑病，又名黄瓜靶斑病、黄瓜褐斑病，是一种世界性分布的病害，主要危害黄瓜叶片，在叶片上形成大量圆形或不规则的黄褐色病斑，发病严重时能引起黄瓜枯萎、早衰[1]。目前，美国[2]、欧洲一些国家[3]、日本[4]、韩国[5]等很多国家均有该病发生和危害的报道。20世纪90年代该病仅在我国的辽宁、河南等黄瓜保护地上发生，至2005年在我国山东、河北、辽宁等多个省份均有发生报道，造成了严重的危害，上升为黄瓜生产中的主要病害[6]。黄瓜棒孢叶斑病的病原为多主棒孢（Corynespora cassiicola），是一种重要的植物病原真菌，寄主范围极为广泛[7]，可以产生寄主选择性毒素[8]。通过对侵染橡胶叶片的多主棒孢毒素作用机理的研究，发现该毒素可以促进寄主和病原菌之间的相互作用，诱导寄主感病[9-10]。目前，对于侵染黄瓜的多主棒孢病原菌的研究主要集中在病原学和防治手段的建立方面，而对于其病原致病机理、毒素活性的研究报道较少。本研究测定在多主棒孢菌孢子及其次生代谢产物毒素悬液作用下，黄瓜植株体内防御酶系过氧化物酶（ POD）、多酚氧化酶（PPO），和超氧化物歧化酶（SOD）的活性变化，通过其活性变化的比较揭示多主棒孢菌毒素在病原致病过程中的作用机理，为进一步研究黄瓜与多主棒孢菌互作关系，以及抗病育种工作的开展提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）HG2：从天津武清区黄瓜棒孢叶斑病发病叶片上分离纯化获得，保存于天津市植物保护研究所种苗病害研究室。

1.2 方 法

1.2.1 多主棒孢菌孢子悬浮液的制备 将PDA斜面保存的多主棒孢菌HG2菌株在PDA平板上活化，然后在PDA培养基上28 ℃恒温培养箱中培养7 d，用灭菌的刮菌器刮下菌丝孢子，配成浓度为1×105 个·mL-1的孢子悬液备用。

1.2.2 多主棒孢菌粗毒素悬液的制备 将活化的HG2菌块接种于150 mL改良的Czapek液体培养基中，每瓶接种5个菌块，25 ℃恒温，120 r·min-1条件下振荡培养。将培养液通过双层灭菌的滤纸过滤除去菌丝体，然后用0.22 μm的微孔滤膜加压抽滤，获得无菌滤液。将获得的无菌滤液保存于-4 ℃冰箱备用。

1.2.3 试验设计 栽培黄瓜苗，在黄瓜植株长出5片真叶时期，采用喷雾接种法在叶片上均匀地接种多主棒孢菌悬液和粗度素悬液。接种后保湿24 h，然后常规管理。每天观察植物叶片上的发病情况和症状变化。自接种后0，1，3，5，7，10，15， 20，25，30 d分别取同一叶龄的叶片，装入样品袋中，放于-20 ℃冰箱中保存。每处理3次重复。

1.2.4 防御酶活性的测定 对1.2.3各处理中的黄瓜在自接种后0，1，3，5，7，10，15，20，25，30 d分别取同一叶龄的叶片，每处理3个重复，测定黄瓜叶片过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和超氧化物歧化酶（SOD） 3种防御酶的活性，3种酶液的提取及活性测定参考耿锐梅的方法[11]。

1.3 数据分析

本试验采用SPSS17.0软件对数据进行处理和统计分析，按照单因素随机方差分析模型，采用Duncan氏新复极差法对同一时间不同处理的酶活变化进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 多主棒孢菌孢子及粗毒素悬液对黄瓜叶片过氧化物酶（POD）活性的影响

多主棒孢菌孢子和毒素悬液处理黄瓜叶片后，引起黄瓜植株体内POD酶的活性显著增加（图1）。经多主棒孢孢子悬浮液处理后，黄瓜叶片产生POD酶活力在0～48 h内显著升高，在48 h时达到最大值57.93 U·g-1·min-1，48 h后随着病原菌的繁殖、病斑的侵染扩散，黄瓜叶片上的POD酶活性显著降低，120 h后POD酶的活性显著低于未接种处理的空白对照。经毒素喷雾接种的处理，黄瓜植株体内POD酶的活性也显著升高，0～48 h内POD酶活力升高的幅度显著高于接种孢子悬液的处理，在24 h时达到最大值43.70 U·g-1·min-1，低于接种孢子悬浮液处理的POD酶活力的峰值，随着毒素接种时间的延长，24 h后POD酶活力显著降低，但其始终高于未接种处理的对照。

2.2 多主棒孢菌孢子及粗毒素悬液对黄瓜叶片多酚氧化酶（PPO）活性的影响

多主棒孢菌孢子和毒素悬液处理黄瓜叶片后，引起黄瓜植株体内PPO酶的活性显著变化（图2）。多主棒孢孢子悬浮液喷施的黄瓜叶片PPO酶活力在0～48 h内呈现显著的升高， 48 h时酶活力达到最大值669.33 U·g-1·min-1，48 h后PPO的酶活力显著下降，到120 h后酶活力低于未处理的空白对照。毒素悬液处理的黄瓜叶片，在0～24 h内PPO酶的活性显著升高，24 h时达到最大631.27 U·g-1·min-1，略低于病原菌孢子悬浮液处理的黄瓜叶片内的PPO酶活力的峰值，24 h后毒素悬液处理的黄瓜体内PPO酶活力逐渐降低，但始终高于空白对照黄瓜叶片上PPO酶活力。

2.3 多主棒孢菌孢子及粗毒素悬液对黄瓜叶片超氧化物歧化酶（SOD）酶活性的影响

多主棒孢菌孢子和毒素悬液处理黄瓜叶片后，对黄瓜植株体内的SOD酶活性具有显著的影响（图3），不同时间段测定的SOD酶活性均显著高于未经处理的对照叶片，说明在病原及毒素的诱导下黄瓜植株对其胁迫产生一定的抗性应答。在多主棒孢孢子悬浮液作用下，黄瓜植株体内的SOD酶活性在0～72 h时内出现缓慢上升，说明在病原菌初期的诱导作用下，黄瓜对其侵染做出一定的应答，在病原侵入繁殖的72 h时达到最大为58.20 U·g-1·min-1，而后随着病原菌的大量繁殖与侵染面积的扩大，其对病原胁迫的抵御力降低，表现在测定的SOD酶活性也逐渐降低。在毒素接种黄瓜叶片后，0～24 h内黄瓜叶片对其胁迫的应答较不敏感，SOD酶活性变化不显著，而24～48 h后，黄瓜叶片对胁迫作出强烈应答，毒素接种的叶片内SOD酶活性显著升高至48 h达到峰值为67.71 U·g-1·min-1，随后SOD酶活性显著降低但均高于对照。通过对病原孢子悬液和毒素悬液处理后黄瓜叶片内SOD酶活性的比较发现，毒素对SOD酶活性的诱发作用显著高于病原菌菌悬液，表现在毒素作用后SOD酶活性的峰值出现时间早于且高于菌悬液处理。

3 结论与讨论

植物病原真菌寄主选择性毒素对寄主植物具有特异性生理活性和专化性作用位点，可诱发寄主产生典型的病害症状[12]，该毒素可认为是一种致病因子，对病害的发生起决定性作用，可以对寄主的生理生化代谢、酶系统活性及核酸代谢等产生显著的影响[13]。目前已发现有隶属于9个属下的21种病原真菌可以产生寄主选择性毒素[12]。寄主植物受到病原菌的侵染时，植物体内发生复杂变化，其中：过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）可抵御逆境中过量的活性氧对寄主细胞膜的损害[14-15]；多酚氧化酶（PPO）是植物组织中的末端氧化酶，是抵御病原物入侵的重要防御酶[16]。而在此过程中，毒素因子对其相关代谢酶活性的影响是否存在一定作用，在诱发寄主植物感病中的作用方式是毒素致病机理研究的途径之一[17-18]。

本研究对酚类代谢相关酶如过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）及过氧化物代谢相关酶超氧化物歧化酶（SOD）在病原多主棒孢菌孢子悬浮液和毒素溶液分别处理作用下黄瓜叶片内酶活性变化情况的测定，分析不同因素对黄瓜叶片胁迫力的大小，及黄瓜叶片对胁迫反应的抵御能力，从而推测多主棒孢毒素的作用机理。

研究表明，寄主植物黄瓜在受到多主棒孢菌孢子悬液和毒素危害后，各处理黄瓜叶片中的过氧化物酶（ POD）、多酚氧化酶（PPO）及过氧化物代谢相关酶超氧化物歧化酶（SOD）的活性均呈现了显著的升高，高于未接种处理的叶片，毒素处理的叶片酶活性高峰值的出现均比菌悬液处理的早出现24 h，说明毒素悬液对寄主体内酶活的激发作用强于菌悬液处理。而随着病原菌的繁殖、侵染、扩散，黄瓜本身对病原菌的抵御力降低，在大量病原菌的威胁下相应的酶活性出现显著的降低，低于对照未处理植株体内的酶活性。通过研究发现，多主棒孢菌孢子悬液和毒素对黄瓜叶片细胞POD、PPO和SOD活性的影响具有一定的相似性，说明病原孢子和毒素在对寄主酶系统活性的影响中具有基本一致的作用，毒素可以代替病原菌开展作用机理的研究。同时，发现毒素对寄主植物的激发作用要强于菌悬液，毒素的产生可促进病原菌的侵染。由于黄瓜棒孢叶斑病发病症状具有多样性，寄主与病原间存在复杂的互作关系，要彻底了解多主棒孢菌及其毒素在病原致病过程中的作用机制，还需要更多的研究。

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