类风湿性关节炎患者外周血单核细胞中miR-146a及miR-155的表达变化

周亚丽，郭向华，邵莉，王少春，陈东风

(1青岛大学附属医院，山东青岛 266003;2 济宁医学院附属医院)



类风湿性关节炎患者外周血单核细胞中miR-146a及miR-155的表达变化

周亚丽1，郭向华2，邵莉2，王少春2，陈东风2

(1青岛大学附属医院，山东青岛 266003;2 济宁医学院附属医院)

目的 探讨miR-146a及miR-155在类风湿性关节炎(RA)患者外周血单核细胞中的表达情况。方法 RA患者30例(RA组)，其中活动期22例、非活动期8例，正常对照组10例。提取外周血分离单核细胞，提取microRNA，应用实时定量聚合酶链反应检测miR-146a及miR-155的表达，以小分子RNA U6作为内参，计算microRNA的相对表达量，以2-ΔΔCT表示。 结果 RA组及正常对照组外周血单核细胞中miR-146a的相对表达量分别为5.99±5.27、3.19±4.24，两组比较，t=-2.335，P<0.05；miR-155的相对表达量分别为0.009±0.005、0.010±0.005，两组比较，t=0.091，P>0.05。miR-146a在RA活动期患者及非活动期患者外周血单核细胞中的相对表达分别为 0.607±0.185、0.225±0.006， 两组比较，t=2.455，P<0.05；miR-155在RA活动期及非活动期患者外周血单核细胞中的相对表达分别为 0.008±0.005、0.010±0.005，两组比较，t=0.154，P>0.05。结论 RA患者外周血单核细胞中miR-146a异常高表达，而miR-155的表达未见升高。

类风湿性关节炎；外周血单核细胞；miRNA-146a；miRNA-155

microRNA(miRNA)是一类来源于内源性染色体的非编码单链小RNA，长21～25个核苷酸。尽管miRNA所含碱基较少，但其在固有免疫、炎症反应及肿瘤发生等各种生物学过程中发挥重要调节作用。目前已有多篇文献报道miRNA在肿瘤中的表达情况。miRNA在甲状腺癌、鼻咽癌、食管癌中呈高表达[1～3]，在结肠癌中呈低表达[4]。目前在自身免疫系统疾病中研究miRNA者较少。类风湿性关节炎(RA)是一种最为常见的系统性自身免疫性疾病，以关节慢性滑膜炎症为特征，在发病两年内即可出现不可逆关节损害[5～7]。本研究观察了早期类风湿性关节炎患者外周血单核细胞中miR-146a及miR-155的表达情况。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2014年10月～2015年5月来自济宁医学院附属医院门诊及住院RA患者30例(RA组)，均符合2009年美国风湿病协会(ACR)和欧洲抗风湿病联盟(EULAR)修订的RA分类标准和评分系统。男8例、女22例，年龄18～68岁，病程1～24个月、中位病程4.5个月，排除其他结缔组织疾病如系统性红斑狼疮、干燥综合征、骨关节炎、冠心病、高血压、糖尿病、妊娠及哺乳期妇女等。根据患者28个关节疾病活动性评分系统将RA患者分为活动期及非活动期，30例患者中活动期22例、非活动期8例。正常对照组10例，为健康志愿者，男1例、女9例，年龄23～52岁，无关节炎的相关症状及体征。

1.2 外周血单核细胞miR-146a及miR-155表达的检测 收集RA患者及正常人外周血9 mL，分离外周血单核细胞。采用实时定量聚合酶链反应检测miR-146a及miR-155的相对表达量。核酸提取：在洁净的1.5 mL的离心管中加入1 mL红细胞裂解液，取抗凝血0.5 mL混匀。室温静置10 min。以5 000 r/min 离心5 min，弃上清，收集底部的细胞。再次重复上述两个步骤一遍。向细胞中加入1 mL TRIzol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静止5 min。加入0.2 mL氯仿，振荡均匀。14 000 r/min、4 ℃ 离心10 min，吸取上清层转移至另一新的离心管中。加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10 min。14 000 r/min、4 ℃ 离心10 min，弃上清，加入75%乙醇1 mL，轻轻上下颠倒洗涤管壁。14 000 r/min、4 ℃ 离心5 min，弃乙醇。室温干燥10～15 min，加入20 μL RNase-free 水溶解沉淀。逆转录：miRNA 3′末端进行加Poly (A)处理：在冰上预冷RNase Free的反应管内加入Total RNA 8 μL、E.coli Poly(A) Polymerase(5 U/μL) 0.4 μL、10×Poly(A) Polymerase Buffer 2 μL、5×rATP Solution 4 μL、RNase-Free ddH2O 5.6 μL至总体积20 μL。轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在37 ℃反应60 min。所得的反应液可以直接进行下游实验。Poly (A)修饰的miRNA进行逆转录反应：将上述所得反应液，按Poly(A)反应液2 μL、10×RT Primer 2 μL、10×RT Buffer 2 μL、Super Pure dNTPs (2.5 mmol/L) 1 μL、RNasin (40 U/μL) 1 μL、Quant RTase 0.5 μL、RNase-Free ddH2O 11.5 μL的方法进行配制，用于合成第一链cDNA。轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在37 ℃反应60 min。合成的cDNA反应液可放置于-20 ℃保存。荧光定量:相关正向引物序列：hsa-miR-146a-5p qPCR Primer：5′-AGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3′;hsa-miR-155-5p qPCR Primer：5′-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3′;U6 F 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;U6 R 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR配制体系：2×miRcute miRNA Premix 10 μL、F(10 μmol/L)0.4 μL、R(10 μmol/L) 0.4 μL、第一链cDNA 2 μL、50×ROX Reference Dye 1.6 μL、RNase-Free ddH2O 5.6 μL。qPCR反应程序：94 ℃、2 min,1个循环。94 ℃、20 s，60 ℃、34 s，40个循环。在ABI 7500荧光定量PCR仪器上进行实时荧光定量PCR，每个标本做3个复孔。反应结束后做熔解曲线分析。计算各标本平均Ct值，以小分子RNA U6作为内参，miR-146a及miR-155的Ct值减去U6 Ct值为ΔCT值。miRNA的相对表达量用2-ΔΔCT表示[8]。

2 结果

2.1 两组外周血单核细胞miR-146a、miR-155的相对表达量比较RA组及正常对照组外周血单核细胞中miR-146a的相对表达量分别为5.99±5.27、3.19±4.24，两组比较，t=-2.335，P<0.05；miR-155的相对表达量分别为0.009±0.005、0.010±0.005，两组比较，t=0.091，P>0.05。

2.2RA活动期及非活动期患者mi-146a及miR-155的相对表达量比较miR-146a在RA活动期患者及非活动期患者外周血单核细胞中的相对表达量分别为0.607±0.185、0.225±0.006，两组比较，t=2.455，P<0.05；miR-155在RA活动期及非活动期患者外周血单核细胞中的相对表达量分别为0.008±0.005、0.010±0.005，两组比较，t=0.154，P>0.05。

3 讨论

miRNA广泛存在于哺乳动物、线虫、植物及病毒中，是一种可调节基因表达、调节生长发育、维持机体正常生理功能的一类重要的非编码RNA，其命名规则为miR-#，#为阿拉伯数字。高度同源的miRNA，则在阿拉伯数字后面加上小写字母，如miR-146a、miR-146b、miR-196a、miR-196b等。

Pauley等[9]发现，miR-146a、miR-155在RA患者外周血单核细胞中的表达均显著高于正常对照组，其表达倍数分别为2.6倍及1.8倍。并将患者根据C反应蛋白及红细胞沉降率分为活动期及非活动期，发现活动期患者miR-146a表达水平明显高于非活动期患者。Stanczyk等[10]发现miR-146a在RA成纤维细胞中的表达显著高于对照组骨关节炎患者，但是miR-155在外周血单核细胞中的表达与对照组骨关节炎患者差异无统计学意义。冯知涛等[11]通过实时荧光定量PCR检测40例RA患者外周血miR-146a及miR-16的表达，发现其在RA患者中表达水平显著高于健康人群，并发现miR-146a及miR-16在RA活动组中表达水平显著高于缓解组及正常对照组，认为miR-146a及miR-16的表达水平可作为RA疾病活动的有效指标。王楷文等[12]发现，miR-146a在RA活动期患者血浆中的表达水平明显高于非活动期。尹志华等[13]发现，miR-146a及miR-155在RA患者外周血单核细胞中的表达分别是正常对照组的1.68倍及1.74倍，同时发现在RA患者外周血浆中miR-146a及miR-155的表达分别是正常对照组的2.47倍及4.65倍，所以其认为血浆中miRNA比外周血单核细胞中miRNA可以更好地作为RA的生物标志物，且还可以作为RA活动的预测指标。以上研究表明在RA患者的多种组织中miR-146a及miR-155均异常表达。本研究结果显示，miR-146a在RA患者外周血单核细胞中的表达高于正常对照组，是正常对照组的1.87倍，且miR-146a在RA活动期患者中的表达高于非活动期患者，与上述研究结果类似，其表达上调可能与RA发病机制有关，但是miR-155的表达于RA组及正常对照组之间及RA活动期患者与非活动期患者之间差异均无统计学意义，可能与种族、实验条件、所选患者及患者例数有关。Taganov等[14]研究发现，在受到脂多糖刺激时，人类单核细胞中miR-146a表达上调。上调的miR-146a作用于肿瘤坏死因子受体相关因子6和白细胞介素1受体相关激酶，这两种蛋白都是Toll样受体和细胞因子信号通路中重要的信号蛋白，miR-146a通过抑制上述两种靶蛋白表达，实现对Toll样受体信号通路的负反馈调节，从而防止炎症反应过激。

理想的miRNA标志物是在患者血液中呈中等或者高水平表达，而在健康人群血液中检测不到或者呈低水平表达。本研究结果虽然可以证实miR-146a的表达在RA患者和正常人群中的差异，miR-146a可能是RA的潜在预后预测指标，但是若想确定其是否可以作为RA诊断指标，尚需扩大入选患者数量进行深入研究，进一步阐明miR-146a在RA发病机制中的可能作用，并且需要在其他结缔组织疾病中验证。而miR-155在RA中的表达情况仍需进一步验证。

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山东省医药卫生科技发展计划项目(2013WS0338)；济宁医学院附属医院苗圃科研项目(JYFY-MP-2013-MS-008)。

陈东风(E-mail:37691289@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.026

R593.22

B

1002-266X(2016)45-0077-03

2016-08-18)