miR-425对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响及其机制

朱红芳，潘群，李春霞，王丽琼

(武汉市武昌医院，武汉430063)



miR-425对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响及其机制

朱红芳，潘群，李春霞，王丽琼

(武汉市武昌医院，武汉430063)

目的 探讨miR-425对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响及其机制。 方法 RT-PCR测定卵巢细胞系SKOV3及正常卵巢细胞系HOSE中miR-425表达水平，将SKOV3细胞分为lent-shmiR-425和lent-shvector组，分别转染lent-shmiR-425和lent-shvector，24 h后行细胞划痕试验和Transwell侵袭小室试验。应用TargetScan预测miR-425与PTEN因子3′端非翻译区结合位点。将SKOV3细胞分成3组:野生型质粒组、突变型质粒组、阴性对照组，分别共转染miR-425及野生型荧光素酶报告质粒pGL3-PTEN 3′UTR，miR-425和突变型荧光素酶报告质粒pGL3-PTEN 3′WT，miR-425和对照荧光素酶质粒，用荧光素酶试验检测各组荧光素酶活性。结果 在卵巢癌细胞系SKOV3中miR-425相对表达量为2.1，正常卵巢细胞系HOSE为1.0，两者比较，P<0.05。lent-shmiR-425组划痕愈合率为27.56%±2.14%，lent-shvector组划痕愈合率为89.15%±6.24%，两组比较，P<0.05。lent-shmiR-425组侵袭细胞数为(75±10)个/200倍视野，lent-shvector组侵袭细胞数为(160±20)个/200倍视野，两组比较，P<0.05。TargetScan预测miR-425与PTEN因子3′端非翻译区的结合位点结合；野生型质粒组、突变型质粒组、阴性对照组荧光素酶活性分别为23.70±0.93、99.27±5.90、104.00±4.02。野生型质粒组低于突变型质粒组和阴性对照组(P均<0.05)。突变型质粒组与阴性对照组比较，P>0.05。结论 miR-425水平升高可促进卵巢癌细胞迁移和侵袭，其机制可能与miR-425靶向调节PTEN表达有关。

卵巢肿瘤；miR-425；迁移；侵袭

卵巢癌被认为是肿瘤致死性疾病的第五大元凶[1],其在诊断时往往已进入晚期[2]。如何快速早期发现卵巢癌，监控其侵袭转移并实施治疗，成为卵巢癌治疗倍受关注的问题。微小RNA(miRNA)已被证明是肿瘤发生发展过程中的调节因子[3]，其在后转录水平通过部分绑定到靶标mRNA，导致mRNA降解以及翻译抑制[4]，精确调控细胞增殖、凋亡、迁移和免疫反应等[5]。miR-425家族包括miR-425、miR-425-3p和miR-425-5p。miR-425在乳腺癌中的功能已被报道[6]。PTEN是人类发现的第一个具有双磷酸酶活性的抑癌基因，其异常广泛存在于人类多种恶性肿瘤中[6]。然而，miR-425在卵巢癌中的表达及其与PTEN基因的关系，以及在卵巢癌发生发展中的作用尚不清楚。2015年2月～2016年2月，本研究着重探讨了miR-425对卵巢癌迁移和转移的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 卵巢癌细胞系SKOV3和正常人卵巢上皮细胞系HOSE购自武汉大学医学院实验中心。Lipofectamine 2000 转染试剂盒(Invitrogen，Carksbad，CA，USA),实验所需一抗(santa公司)，二抗(武汉博士德生物有限公司)，RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(美国Hyclone公司),lent-shmiR-425和lent-shvector(RiboBio公司)。TRIzol(Invitrogen，Carksbad，CA，USA),All-in-One microRNA抽提试剂盒和All-in-One miRNA qRT-PCR检测试剂盒 (GeneCopoeia, Carlsbad, CA, USA)，ABI Prism7700 System(ABI, Foster City,CA,USA)，SYBR Green Reagents (TaKaRa, Tokyo, Japan)

1.2 细胞培养及转染 SKOV3和HOSE细胞系置于添加了10% FBS的RPMI1640培养基中，37 ℃、5% CO2培养。取对数期SKOV3细胞分成lent-shmiR-425组及lent-shvector组，依照Lipofectamine 2000 转染试剂盒说明书对两组分别转染lent-shmiR-425和lent-shvector，最终转染浓度为20 nmol/L。培养24 h后行细胞划痕及Transwell侵袭小室试验。

1.3 细胞miR-425基因的相对表达量检测 采用RT-PCR 法。采用All-in-One microRNA抽提试剂盒提取细胞总miRNA, All-in-One miRNA qRT-PCR检测试剂盒分离miRNAs。按试剂盒说明书进行qRT-PCR反应。miR-425和U6的引物由GeneCopoeia (Carlsbad, CA, USA)设计,反应体系：1×Taq Buffer 2 μL,25 mmol/L MgCl21.2 μL, 10 mmol/L dNTP 0.2 μL,10 pmol/μL上游引物0.4 μL,10 pmol/μL下游引物0.4 μL,cDNA模板 1 μL,DEPC水 14.7 μL，2.5 U/μL Taq酶0.1 μL。反应条件：95 ℃ 预变性10 min, 95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，在4 ℃下共40个循环。使用2-ΔΔCt方法定量，以U6小核RNA作为内参，计算miR-425基因的相对表达量。

1.4 细胞迁移能力的检测 采用细胞划痕试验。将lent-shmiR-425组和lent-shvector组细胞培养于6孔板，待细胞融合后，用无菌枪头沿直线用力划直线。计算划痕愈合率。划痕愈合率=(迁移前划痕面积-迁移后划痕面积)/迁移前划痕面积×100%。重复3次。划痕愈合率越高，表示迁移能力越高。

1.5 细胞侵袭能力的检测 采用Transwell侵袭小室试验。lent-shmiR-425组和lent-shvector组各取5×104细胞, 种在Transwell小室的碳酸磷脂表面，含10 % FBS的 RPMI1640置于下层作为化学引诱物。孵育24 h后，移走上层细胞。迁移侵染的细胞与4%聚丙烯混合，0.2%结晶紫染色，显影并在倒置显微镜200倍视野下观察计数。随机取10个视野，实验重复3次，取平均值。

1.6 生物信息学分析及预测 通过TargetScan(http://www.targetscan.org)、mirDB(http://mirdb.org)及PicTar(http://pictar.bio.nyu.edu)三种生物信息学软件预测可能靶向作用于PTEN的miRNA。

1.7 miR-425与PTEN靶向关系的验证 采用荧光素酶试验。细胞转染前24 h, 将SKOV3细胞接种于24孔板中，分成野生型质粒组、突变型质粒组及阴性对照组，野生型质粒组共转染miR-425及野生型荧光素酶报告质粒pGL3-PTEN 3′UTR，突变型质粒组共转染miR-425和突变型荧光素酶报告质粒pGL3-PTEN 3′WT，阴性对照组共转染miR-425和对照荧光素酶质粒。转染培养24 h后，使用双荧光素酶报告基因系统进行荧光活性检测。独立重复试验3次，每次6个复孔。以海肾荧光素光吸收值作为内参。萤光素酶活性=萤火虫荧光素光吸收值/海肾荧光素光吸收值。

2 结果

2.1 不同细胞系中miR-425的表达比较 在卵巢癌细胞系SKOV3中miR-425相对表达量为2.1，在正常卵巢细胞系HOSE中miR-425相对表达量为1.0，两者比较，P<0.05。

2.2 各组细胞迁移和侵袭能力比较lent-shmiR-425组与lent-shvector组miR-425表达量分别为0.16和1.98,提示lent-shmiR-425沉默表达成功。24h后，lent-shmiR-425组划痕愈合率为27.56%±2.14%，lent-shvector组划痕愈合率为89.15%±6.24%，两组比较，P<0.05。lent-shmiR-425组侵袭细胞数为(75±10)个/200倍视野，lent-shvector组侵袭细胞数为(160±20)个/200倍视野，两组比较，P<0.05。

2.3 各组荧光素酶活性比较 野生型质粒组、突变型质粒组、阴性对照组分别为23.70±0.93、99.27±5.9、104.00±4.02。野生型质粒组显著低于突变型质粒组和阴性对照组(P均<0.05)。突变型质粒组与阴性对照组相比，P>0.05。

3 讨论

卵巢癌是起源于上皮细胞的恶性肿瘤。因发现时往往是晚期及恶性程度高，卵巢癌预后不佳、进展较快。明确卵巢癌的恶性肿瘤生物学特征及其机制对设计新的治疗药物和手段具有重要意义。

miRNA是含有茎环结构的RNA前体，经过Dicer加工后的一类非编码的小分子RNA(18～25个核苷酸)，通过与靶基因的种子区序列相互配对抑制其基因的转录或翻译，广泛存在于真核生物体中。研究发现，miRNA在多种肿瘤组织包括卵巢癌中均有特异性的表达谱，参与肿瘤发生、发展、转移的各个阶段，且每一个阶段都有相应的基因发生改变，同时也有调控这些基因的miRNA发生变化。已有研究表明，miR200c、miR141、miR199a、miR145、miR130和miR101等miRNA对卵巢癌细胞生长过程均有不同程度的调控[7]。另有研究表明，miR-425可以调控乳腺癌细胞的增殖、提高肺癌细胞的侵袭性。本研究结果显示，在卵巢癌细胞系中miR-425高表达，在SKOV3中转染lent-shmiR-425下调miR-425表达，行细胞划痕及迁移试验，发现下调miR-425表达后卵巢癌细胞迁移和侵袭能力减弱。提示miR-425促进卵巢癌迁移和侵袭，起促癌作用。

PTEN是肿瘤抑制子家族中的一员，也是迄今为止发现的第一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，广泛参与包括细胞增殖、再生、凋亡、迁移和侵袭等生物学过程。PTEN定位于染色体10q23，可通过调节磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶等多种信号转导途径，调控细胞周期和迁移[8]。有研究认为，PTEN基因敲除导致的胃癌可被miR-236介导的cyclinD1/cdc25A信号通路调控。有研究显示，miR-205通过靶向作用于PTEN调节人类鼻咽癌的抗辐射性。本研究通过TargetScan预测到miR-425与PTEN因子3′端非翻译区的结合位点。双荧光素酶试验发现，野生型质粒组荧光素酶活性低于突变型质粒组和阴性对照组，证实miR-425与PTEN是靶向调节关系。本研究首次在卵巢癌中研究miR-425的表达及对卵巢癌迁移和侵袭的影响，是对miRNA在卵巢癌细胞中表达谱的有益补充，是对卵巢癌肿瘤生物学行为的进一步揭示，有可能成为一种新的治疗分子靶标。

[1]UssetJL,RaghavanR,TyrerJP，etal.Assessmentofmultifactorgene-environmentinteractionsandovariancancerrisk:candidategenes,obesity,andhormone-relatedriskfactors[J].CancerEpidemiolBiomarkersPrev， 2016，25(5):780-790.

[2]HardwickN,FrankelPH,CristeaM.Newapproachesforimmunedirectedtreatmentforovariancancer[J].CurrTreatOptionsOncol, 2016,17(3):1-8.

[3]VitaloneMJ,WeiL,FujikiM,etal.LivermicroRNAprofileofinducedallografttolerance[J].Transplantation, 2016,100(4):781-790.

[4]WangD,LiZ,ZhangY,etal.TargetingofmicroRNA-199a-5pprotectsagainstpilocarpineinducedstatusepilepticusandseizuredamageviaSIRT1-p53cascade[J].Epilepsia, 2016，57(5):706-716.

[5]WangG,CaiC,ChenL.MicroRNA-3666regulatesthyroidcarcinomacellproliferationviaMET[J].CellPhysiolBiochem, 2016,38(3):1030-1039.

[6] 张刚，李中，林晓萌，等.乳腺浸润性导管癌组织中PTEN和p53表达变化及意义[J].山东医药,2014,54(32):30-32.

[7]ZhaoG,GuoY,ChenZ,etal.miR-203functionsasatumorsuppressorbyinhibitingepithelialtomesenchymaltransitioninovariancancer[J].JCancerSciTher, 2015,7(2):34.

[8]TesioM,TrinquandA,MacintyreE,etal.OncogenicPTENfunctionsandmodelsinT-cellmalignancies[J].Oncogene, 2016,35(30):3887-3896.

王丽琼(E-mail:liqiongwang@21cn.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.011

R737.31

A

1002-266X(2016)45-0037-03

2016-06-08)