HHIP基因单核苷酸多态性与新疆维吾尔族慢性阻塞性肺疾病易感性的相关性

任侠，关键，张中宏，梁文晋，宋丽军，成芳娟，马程远

(石河子大学医学院第一附属医院，新疆石河子832008)



HHIP基因单核苷酸多态性与新疆维吾尔族慢性阻塞性肺疾病易感性的相关性

任侠，关键，张中宏，梁文晋，宋丽军，成芳娟，马程远

(石河子大学医学院第一附属医院，新疆石河子832008)

目的 探讨人音猬因子相互作用蛋白(HHIP)基因单核苷酸多态性与新疆维吾尔族慢性阻塞性肺疾病(COPD)易感性之间的关系。方法 以233例维吾尔族COPD患者为病例组，292例维吾尔族健康体检者为对照组，提取外周血标本DNA，运用iMLDR分型技术检测HHIP基因rs13118928A/G、rs13141461C/T位点多态性。结果HHIP基因rs13118928A/G、rs13141461C/T位点在病例组与对照组中的基因型及等位基因频率分布比较，P均>0.05。两个位点的4种单体型(AC、AT、GC、GT)在对照组和病例组中的分布比较，P均>0.05。rs13141461C/T基因加性模型(GGvs.AGvs.AA)与第1秒用力呼气容积/用力肺活量(FEV1/FVC)有关(P均<0.05)，隐性模型(CC+CTvs.TT)与FEV1占预计值的百分比(FEV1%pred)和FEV1/FVC都有关(P均<0.05)。结论HHIP基因rs13118928A/G可能不是新疆维吾尔族COPD人群易感位点，rs13141461C/T基因加性模型(GGvs.AGvs.AA)与FEV1/FVC有关，隐性模型(CC+CTvs.TT)与FEV1%pred和FEV1/FVC有关。

肺疾病，慢性阻塞性；人音猬因子相互作用蛋白；核苷酸多态性；维吾尔族；新疆

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以不完全可逆性气流受限为特征的疾病状态，气流受限呈进行性，并伴有肺对毒性颗粒或气体的异常炎症反应，是一种复杂的多因素疾病[1]，可能受环境和基因突变因素影响。目前COPD的发病机制仍未完全阐明。Hh信号通路在细胞生长分化、血管重建、胚胎发育中起重要作用。人音猬因子相互作用蛋白(HHIP)基因位于染色体4q31.21～31.3，参与维持正常肺功能及肺泡结构，作用于人肺上皮细胞的Hh通路，使其出现功能障碍，并导致肺发育畸形，在发育成熟肺中可促进肺纤维化[2,3]。研究显示，HHIP基因多态性与COPD易感性存在种族差异，该基因是否与新疆维吾尔族人群COPD易感性相关尚不清楚。本研究旨在探讨新疆维吾尔族人群HHIP rs13118928、rs13141461基因多态性与COPD易感性的相关性，从分子水平研究新疆地区维吾尔族人群COPD病程进展中遗传因素的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年10月～2016年8月本院诊断为COPD的维吾尔族患者233例(病例组)，男145例、女88例，年龄(63.30±10.67)岁，同期在体检中心进行健康体检的维吾尔族健康人292例作为对照组，其中男168例、女124例，年龄(61.68±9.55)岁。纳入标准：吸入支气管舒张剂后第1秒用力呼气容积/用力肺活量(FEV1/FVC)<70%，FEV1占预计值的百分比(FEV1%pred)>80%。排除合并肺癌、支气管哮喘、其他慢性呼吸系统疾病等影响肺功能测定结果的疾病。

1.2 方法

1.2.1 HHIP基因组DNA提取 清晨采集入选对象肘正中静脉血2 mL，EDTA管抗凝混匀，严格按照由北京TIANGEN公司提供的离心柱型试剂盒说明书提取DNA，采用NanoDrop-2000核酸蛋白测序仪检测DNA浓度及纯度，-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 HHIP基因多态性检测 ①引物设计与合成:根据GenBank提供基因序列，运用Primer4.0软件对引物进行设计，可得到用于特异性扩增的PCR上、下游引物和延伸引物，引物合成与设计均由上海天昊生物科技有限公司完成。其中rs13118928A/G：上游引物：5′-TTTCTGAGCAGGGAGGGCATCT-3′，下游引物：5′-GGAATTTCTCACAGTGCACACAGG-3′，扩增长度299 bp；rs13141461C/T：上游引物：5′-GGTGTGTCCTGCCAATCCAAAG-3′，下游引物：5′-TCTCCACCCCAACCAATTAGCA-3′，扩增长度285 bp。②PCR反应：PCR扩增：PCR反应体系(10 μL)包含1×GC-Ⅰ buffer(Takara), 3.0 mmol/L Mg2+, 0.3 mmol/L dNTP, HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc)1 U，样本DNA 1 μL和多重PCR引物1 μL。PCR反应条件：95 ℃ 预变性2 min；94 ℃ 20 s，65 ℃ 40 s，72 ℃ 1.5 min,11个循环变性，每个循环温度降低0.5 ℃；94 ℃ 20 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min,24个循环退火；72 ℃延伸2 min；反应结束，4 ℃保存。PCR反应产物纯化：在剩余的PCR反应体系中加入虾碱酶5 U和外切核酸酶2 U，37 ℃温浴1 h, 然后75 ℃灭活15 min。连接反应：反应体系包括10×连接缓冲液1 μL、高温连接酶0.25 L、5′连接引物混合液(1 μmol)0.4 μL，3′连接引物混合液(2 μmol) 0.4 μL、纯化后多重PCR产物2 L、ddH2O 6 μL 充分混匀。反应条件： 94 ℃ 1 min，56 ℃ 4 min，38个循环，反应结束后4 ℃保存。延伸产物测序：取0.5 μL稀释后的连接产物，与Liz 500 SIZE STANDARD 0.5 μL，Hi-Di 9 μL混匀，95 ℃变性5 min后通过ABI3730XL测序仪的毛细管电泳来区分，原始数据文件用GeneMapper4.1软件(Appliedbiosystems)来分析。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。两组间如符合正态分布采用两独立样本t检验，对Hardy-Weinberg平衡吻合度检验、基因位点分布频率及性别进行χ2检验，HHIP基因单核苷酸多态性位点与肺功能关系采用回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。通过SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/SHEsis Main.htm)在线软件完成单体型分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg 遗传平衡检验 rs13118928A/G、rs13141461C/T两个位点基因型的分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡(P分别为0.079 47、0.053 75)，选取的样本群体代表性良好。

2.2 两组基因型以及等位基因频率分布比较 病例组rs13118928A/G基因型AA、AG、GG分别为67(28.8%)、103(44.2%)、63例(27.0%)，等位基因A、G分别为237(50.9%)、229频次(49.1%)；对照组分别为94(32.2%)、138(47.3%)、60例(20.5%)，326(55.8%)、258频次(44.2%)。病例组rs13141461C/T基因型TT、TC、CC分别为82(35.2%)、114(48.9%)、37例(15.9%)，等位基因T、C分别为278(60.0%)、188频次(40.0%)；对照组分别为90(30.8%)、153(52.4%)、49例(16.8%)，333(57.0%)、251频次(43.0%)。两组rs13118928A/G、rs13141461C/T基因型分布、等位基因频率比较，P均>0.05。

2.3 HHIP基因rs13118928A/G、rs13141461C/T位点单体型分析 通过SHEsis在线软件分析得出rs13118928A/G、rs13141461C/T位点多态性共有4种单体型频率大于1%。对照组单体型AC、AT、GC、GT分别为148.65(0.255)、177.35(0.304)、102.35(0.175)、155.65频次(0.267)，病例组分别为96.28(0.207)、140.72(0.302)、91.72(0.197)、137.28频次(0.295)，OR(95%CI)分别为0.763(0.570～1.021)、0.992(0.761～1.293)、1.153(0.844～1.576)、1.149(0.877～1.507)，P分别为0.07、0.95、0.37、0.31。

2.4 HHIP基因rs13118928A/G、rs13141461C/T基因模型与肺功能的关系 HHIP基因rs13141461C/T单核苷酸多态性加性模型(GG vs. AG vs. AA)与FEV1/FVC有关，隐性模型(CC+CT vs. TT)与FEV1% pred和FEV1/FVC都有关(P均<0.05)，rs13118928A/G与肺功能无关(P均﹥0.05)。

3 讨论

通常情况下，Hh信号通路在机体发育成熟后进入失活状态。在哺乳动物体内，Hh信号通路主要由配体(SHh、IHh、DHh)、膜受体PTCH (PTCH1、PTCH2)和SMO、转录因子Gli(Gli1、Gli2)、Fu抑制剂(SuFu)组成[4,5]。其中PTCH为12次跨膜蛋白，是Hh信号通路的主要受体[6]。PTCH能够通过调控小分子化合物运输间接地调控7次跨膜受体SMO的活性[7]；SMO负责细胞内信号，通过一系列复杂蛋白复合物的作用调控核转录因子Gli的数量及活性，接着Gli家族将信号传导至细胞核。当配体Hh不存在时，膜受体PTCH抑制SMO受体上膜，从而抑制下游通路，导致Hh通路受到抑制。当配体Hh与PTCH结合后，解除PTCH对SMO的抑制作用，使得全长Gli蛋白进入核内激活下游靶基因转录，激活Hh靶基因。HHIP基因编码的糖蛋白能与PTCH竞争性地结合Hh配体，使配体Hh丧失激活Hh信号通路的功能。Hh信号通路异常激活可以引起哮喘、肺癌、COPD发生和发展。

目前HHIP基因已经成为研究热点。Kim等[1]研究发现，HHIP基因rs13118928A/G G等位基因可以降低COPD发病风险。全基因组关联研究发现，rs13118928A/G位点与COPD肺功能FEV1%pred有关。但在国际COPD遗传网络研究高加索人、中国汉族、中国黎族中并未发现此位点与FEV1%pred有关。由于目前HHIP基因位点与COPD之间的关系尚存在争议，因此有必要在不同民族对此位点与COPD的关系进行探讨。

本研究显示，HHIP基因rs13118928A/G、rs13141461C/T位点的基因型及等位基因频率分布在病例组与对照组间比较差异无统计学意义，因此推测两位点与新疆维吾尔族COPD易感性可能无关。单体型分析结果显示，AC、AT、GC、GT 4种单体型在病例组和对照组中分布无统计学意义。肺功能结果提示rs13141461C/T单核苷酸多态性基因加性模型(GG vs. AG vs. AA)与FEV1/FVC有关，隐性模型(CC+CTvs.TT)与FEV1%pred和FEV1/FVC有关。本研究与其他研究结果存在差异，可能原因：①COPD发病原因复杂，此次研究无法进行基因-基因、基因-环境间的交互作用分析；②新疆地域广，维吾尔族属于少数民族，样本收集过程较难，造成此次样本收集偏少，可能会对结果造成一定影响；③HHIP基因位点较多，各位点之间存在连锁不平衡，不能明确起决定性的基因位点。今后有必要进行大样本、多民族、多地区的病例对照研究，构建完整的信息资料库，进一步揭示HHIP基因多态性与COPD易感性的关系。

[1] Kim S, Kim H, Cho N, et al. Identification of FAM13A gene associated with the ratio of FEV1to FVC in Korean population by genome-wide association studies including gene-environment interactions [J]. J Hum Genet, 2015,60(3):139-145.

[2] Liu L, Kugler MC, Loomis CA, et al. Hedgehog signaling in neonatal and adult lung [J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2013,48(6):703-710.

[3] Figeac F, Dagouassat M, Mahrouf-Yorgov M, et al. Lung fibroblasts share mesenchymal stem cell features which are altered in chronic obstructivepulmonary disease via the overactivation of the Hedgehog signaling pathway[J]. PLoS One, 2015,10(3):e0121579.

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[6] Dentice M. Hedgehog-mediated regulation of thyroid hormone action through iodothyronine deiodinases [J]. Expert Opin Ther Targets, 2011,15(4):493-504.

[7] Chuang PT, Kawcak TN, McMahon AP. Feedback control of mammalian Hedgehog signaling by the Hedgehog-binding protein, Hip1, modulates Fgf signaling during branching morphogenesis of the lung [J]. Genes Dev, 2003,17(3):342-347.

Association between single nucleotide polymorphism of HHIP gene and susceptibility to COPD in Uygur patients

RENXia,GUANJian,ZHANGZhonghong,LIANGWenjin,SONGLijun,CHENGFangjuan,MAChengyuan

(TheFirstAffiliatedHospitalofShiheziMedicalUniversity,Shihezi832008,China)

Objective To investigate the relationship between single nucleotide polymorphism of human hedgehog-interacting protein (HHIP) gene and susceptibility to chronic obstructive pulmonary disease (COPD) in Xinjiang Uygur population. Methods We extracted DNA from peripheral blood samples in 233 cases of Uygur patients with COPD (COPD group) and 292 cases of healthy controls (control group), and then detected HHIP gene rs13118928A/G and rs13141461C/T polymorphism loci by iMLDR technique.Results Alleles and genotype frequency distribution of rs13118928A/G and rs13141461C/T in HHIP gene between the COPD group and control group showed no significant difference, allP>0.05. Meanwhile, no significant difference was found in the 4 haplotypes (AC, AT, GC and GT) of rs13118928A/G and rs13141461C/T between the COPD group and control group, allP>0.05. Rs13141461C/T gene log-model (GG vs. AG vs. AA) was related with FEV1/FVC (P<0.05), and the recessive model (CC+CT vs. TT) was related with both FEV1% predicted value (FEV1%pred) and FEV1/FVC (allP<0.05).Conclusions The polymorphism loci of rs13118928A/G may be not the susceptibility gene of COPD in Xinjiang Uygur population. The rs13141461C/T gene log-model (GG vs. AG vs. AA) is related with FEV1/FVC, and the recessive model (CC+CT vs. TT) is related with FEV1%pred and FEV1/FVC.

pulmonary disease, chronic obstructive; human hedgehog-interacting protein gene; single nucleotide polymorphism; Uygur nationality; Xinjiang

国家自然科学基金资助项目(81560009)；石河子大学医学院第一附属医院科研项目(BS2016090)。

任侠(1989-)，女，硕士研究生，主要研究方向为呼吸系统疾病的基础研究。E-mail: 244355830@qq.com

关键(1968-)，男，博士，主要研究方向为呼吸系统疾病的基础及临床研究。E-mail: guanjian6@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.004

R563.13

A

1002-266X(2016)45-0012-03

2016-08-29)