除草剂对斑马鱼毒性效应研究概述

袁桂平，陈靖宇，金晨钟，欧晓明*,2，谭显胜

(1.湖南人文科技学院 农田杂草防控技术与应用协同创新中心/农药无害化应用重点实验室，湖南娄底 417000；2.湖南化工研究院国家农药创制工程技术研究中心，湖南长沙410014)

除草剂对斑马鱼毒性效应研究概述

袁桂平1，陈靖宇1，金晨钟1，欧晓明*1,2，谭显胜1

(1.湖南人文科技学院 农田杂草防控技术与应用协同创新中心/农药无害化应用重点实验室，湖南娄底 417000；2.湖南化工研究院国家农药创制工程技术研究中心，湖南长沙410014)

除草剂的大量、不合理使用对水体造成了严重污染，威胁水生生物的生存及人类健康。不少研究者开始对除草剂生态环境风险评估进行研究。斑马鱼因其自身独特的优势而已成为国际公认的模式脊椎动物之一，是污染物风险评估选用的绝佳材料之一。对斑马鱼在风险评估中的地位、除草剂对斑马鱼及其胚胎的毒性与富集进行了综述。

除草剂；斑马鱼；毒性

杂草不仅与作物竞争养分、阳光、水分，而且还是一些病虫的寄主，使作物的产量大幅下降，使粮食、水果、蔬菜等品质降低。杂草对作物造成的危害不容忽视。根据美国农业部、FAO发布的数据，2014年全球水稻、小麦、玉米总产量在理想状态下分别为70 703万t、72 500万t、102 200万t，按全世界每年因杂草造成农作物减产9.7%计算，水稻、小麦和玉米损失量约为6 858万t、7 033万t和9 913万t。为了更有效地防除杂草，除草方式由费力、费时、低效率、防除效果差的人工除草发展到现在的省力、省时、高效率、防除效果好的化学除草。除草剂的使用给人们提供了便利，并带来巨大的经济效益，但不合理使用造成水体污染，进而威胁水生生物的生存及人类健康。近年来越来越多的研究者开始研究除草剂对水生生物的影响。

斑马鱼因其自身优势被广泛用于农药生态风险评估、环境毒理研究、生命科学研究、人类疾病研究、药物筛选、食品安全检测等领域，是广泛应用的重要指示生物。国内外不少研究者以斑马鱼为试验材料，研究了除草剂对它的毒性效应，从而评估除草剂对水生动物的危害以及对人类健康的影响。据此，本文拟对除草剂对斑马鱼的毒性效应、斑马鱼对除草剂的富集作用等方面进行综述，以飧读者。

1 斑马鱼在风险评估中的地位

最早的“生态风险评价基准”是由美国EPA制定，鱼类和无脊椎动物中的浮游动物是主要生态受体[1]。鱼类在水生生态系统中所处的营养级别高，对水体污染物敏感，且又是脊椎动物的代表性动物，适用于对水体污染物进行生态风险评估。斑马鱼体型小，3～4 mm的幼鱼就可以用来做试验，是目前唯一可进行微孔板高通量试验的脊椎类动物。相对于OECD及相关组织推荐使用的国际鱼种虹鳟鱼、鲤鱼、草鱼等，成年斑马鱼体型小很多，体长5 cm左右，体重0.5 g左右。按照化学农药环境安全评价试验准则，试验溶液容纳量小于1 g/L，供试鱼质量小就会减少供试药品的用量，这对于样品少且难以获得的供试物，选用斑马鱼作试验材料不仅很有必要，而且具有明显优势。一是斑马鱼繁殖能力很强，雌鱼每次产卵300余枚，最多可超过1 000枚，5个月左右的成鱼就可以繁殖下一代，繁殖不受季节的影响。相比于青鳉鱼，斑马鱼的繁殖能力是它的数十倍。二是斑马鱼受精率高达70%～80%，容易获取试验所需要的大量样本。三是斑马鱼世代周期短，斑马鱼体外受精，胚胎孵化，发育快。鱼卵孵化一般只需4 d，受精后24 h，各种器官就基本形成，是用来研究污染物对水生动物多代影响的好材料。此外，斑马鱼胚胎还是污染物风险评价的绝佳试验材料。斑马鱼胚胎透明，借助显微镜就可以看到发育全过程，并且从受精胚胎开始发育到孵化结束，可以观察到约20种不同表现的反应指标[2]，例如卵凝结状况、胚囊发育状况、畸形状况等。斑马鱼胚胎不同时期的形态特点和发育全过程已被研究者熟知[3]，有助于开展风险评估研究。

2 除草剂对斑马鱼的毒性

水生生物慢性毒性试验既可确定干扰水生生物的正常生长、发育和繁殖能的化学污染物浓度，确定污染物对水生生物的最大无作用剂量，还可阐明污染物对水生生物产生慢性毒性作用的性质、靶器官和中毒机制。研究除草剂对斑马鱼的慢性毒性，不仅丰富了除草剂对鱼类的毒性资料，还为制定相关水质标准提供依据，因此受到重视。国外用斑马鱼作为试验材料进行急性毒性研究开始于20世纪70年代末[4]，到了90年代初期，斑马鱼开始被用于急、慢性联合毒性试验[5]，现在斑马鱼是国际标准化组织推荐使用的毒性试验材料[6]。

通常进行急性毒性试验以评价农药对非靶标生物毒性。农药登记时需提供该农药对环境的风险评估资料，其中急性毒性数据是开展风险评估的基石。胡竞进等[7]采用静态法研究了乙草胺对斑马鱼成鱼和胚胎的急性毒性和对胚胎的致畸作用，发现乙草胺对斑马鱼成鱼LC50(96 h)为3.04 mg/L，属中等毒性，对胚胎的LC50(120 h)为5.32 mg/L；斑马鱼受精后胚胎于0.3 mg/L乙草胺中暴露5 d，幼鱼可出现心包囊水肿、脊索弯曲等致畸现象。Cao等[8]研究发现氰氟草酯对斑马鱼成鱼、孵化后12 h的幼鱼、孵化后3 d的幼鱼LC50(96 h)分别为3.49、0.58、1.42 mg/L，这说明该除草剂对斑马鱼具有中等毒性，同时发现当斑马鱼胚胎和幼鱼暴露在1.00 mg/L或更高浓度的氰氟草酯药液中，胚胎孵化率降低，斑马鱼幼鱼自主活动和体长的增长受到抑制。赵倩等[9]以除草剂扑草净作为目标污染物，模式生物斑马鱼作为受试生物，研究了扑草净对斑马鱼的96 h急性毒性以及在腐殖酸(HA)存在下扑草净对斑马鱼的毒性变化情况，结果显示扑草净对斑马鱼的96 h半致死浓度(LC50)为7.448 mg/L，同时发现5 mg/L的HA对扑草净的毒性没有显著影响，但当扑草净浓度为8.5 mg/L时，15 mg/L的HA增加了扑草净对斑马鱼的96 h累积死亡率，较相同扑草净浓度无HA组高40%，这可能是由于较高浓度(大于LC50)的扑草净与HA共存时，减少污染物毒性的络合机制被其他能够引起毒性增加的机制所掩盖。悬浮沉积物可以通过吸附作用降低有机污染物在鱼体内的表观生物富集作用，但是仍不清楚该过程是否也可以减少有机污染物对鱼等非靶标水生生物的毒性。Yan等[10]研究了在天然沉积物存在时莠去津对鱼的毒性，发现在无悬浮沉积物存在下莠去津对斑马鱼的LC50(96 h)为29.06 mg/L，但当在水中添加浓度为7 500、15 000 mg/L悬浮沉积物后，莠去津对鱼的LC50(96 h)分别为 30.74、39.51 mg/L，其无明显效应浓度(NOEC)分别为3、9、15 mg/L。这说明悬浮沉积物可以降低斑马鱼对莠去津的吸收速率，进而降低药剂对鱼的急性毒性。Wirbisky等[11]研究发现经30 μg/L莠去津药液处理的斑马鱼胚胎孵化出的斑马鱼，其产卵量较对照组明显减少，后代头长与体长比值明显减小，头宽与体长比值明显增大，说明该除草剂对斑马鱼的生长发育和生殖有影响。Al-Sawafi等[12]研究了莠去津对斑马鱼的慢性毒性，试验结果表明斑马鱼体内的AChE的活性显著下降，

CAT和SOD活性明显升高(CAT对莠去津的敏感性更高)，说明了该除草剂对斑马鱼具有一定的慢性毒性。Plhalova等[15]将30日龄斑马鱼暴露在0.3、3.0、30.0、90.0 μg/L等不同浓度的莠去津药液中28 d，结果发现当暴露浓度为0.3 μg/L时，斑马鱼的生长和组织发育没有受到任何影响；莠去津对斑马鱼的最大无效应浓度为30 μg/L；对斑马鱼的最低可见效应浓度为90.0 μg/L，在此浓度，斑马鱼生长发育变得迟缓。这对莠去津的科学使用有重要指导意义。

3 除草剂对斑马鱼胚胎发育的影响

很多学者认为在生命的整个过程中，对外源化学物质最敏感的时期是胚胎期[14]。在1998年，斑马鱼胚胎发育法就被OECD列为测定单一化学品毒性的标准方法之一[14]。很多研究者利用斑马鱼胚胎进行急性毒理表型分析，涉及到的化学物质越来越多，包括除草剂、芳香族化合物和杀虫剂等[15]。除草剂的化学结构决定了除草剂的生理活性和毒性，不同除草剂对斑马鱼胚胎发育的影响不同，不同浓度的同种除草剂对斑马鱼胚胎发育的影响也不同，胚胎暴露在同种除草剂同种浓度中，受到的影响会因暴露的时间长短而不同。

胡竞进等[7]根据窗口期暴露试验发现斑马鱼受精3 h后胚胎于0.06 mg/L乙草胺中暴露10、14 d，以及在0.3 mg/L乙草胺中暴露10 d，幼鱼脱碘酶基因(d1、d2)、甲状腺激素受体基因(trα、trβ)、钠/碘同向转运体基因(s1c5a5)、促甲状腺激素释放激素基因(crh)、促甲状腺激素基因(tsh)等的表达呈现不同程度下调，而在0.3 mg/L乙草胺中暴露14 d，除d1的表达量显著上调外，其余各相关基因的表达均无明显变化，这说明乙草胺能够干扰斑马鱼幼鱼早期发育，且在不同暴露浓度和时间下干扰效应存在较大差异。刘迎等[16]采用斑马鱼胚胎发育技术研究了5种酰胺类除草剂对斑马鱼胚胎的致死效应和致畸效应，结果发现随着染毒剂量的增加，斑马鱼胚胎孵化率逐渐降低，甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺和异丙甲草胺等5种酰胺类除草剂显示出相似的趋势，处理质量浓度与胚胎孵化率之间存在剂量-效应关系，均诱导斑马鱼胚胎出现心包囊水肿、游囊关闭、躯干弯曲等症状，对斑马鱼胚胎的致畸指数分别为1.53、1.59、1.89、2.50、2.44，均具有致畸效应。Xu等[17]研究证实，当斑马鱼胚胎暴露在2、8、15、30、60 μM等系列浓度的乙草胺及其对映异构体试验液中，斑马鱼胚胎死亡率与暴露时间和暴露浓度呈正相关关系，LC50(72 h)为48.4～53.1 μM，在暴露期间斑马鱼胚胎还表现出一定的畸形现象如卵黄囊水肿，EC50(48 h)为36.7～54.1 μM。Roy等[18]研究发现将处于原肠胚期的斑马鱼胚胎暴露在50 μg/mL的草甘膦溶液中，发现50 μg/mL草甘膦会引起斑马鱼心房和心室结构异常。Zhu等[19]将斑马鱼胚胎暴露在不同浓度的氰氟草酯溶液中，受精后120 h内不同时间段胚胎的死亡数证明了氰氟草酯对斑马鱼胚胎具有高度毒性。张洪等[20，21]为了获知水环境中亚致死剂量的氯吡嘧磺隆对斑马鱼肝脏的影响，将斑马鱼暴露在亚致死剂量的氯吡嘧磺隆药液中8 d，采用超高效液相色谱与四级杆-轨道离子阱质谱串联对斑马鱼的肝脏代谢物进行分析，采用SIEVE软件将图谱信息转换为含有保留时间、质荷比和相对峰面积的二维数据阵，结合mz Cloud，Human Metabolome Database(HMDB)数据库共鉴定出氨基酸、糖、有机酸等33种代谢物。采用SIMCA软件对正离子和负离子模式下的检测结果进行主成分、偏最小二乘法和正交校正的偏最小二乘法，结果发现对照组与处理组的代谢物在2种检测模式下均存在显著差异，认为肌酸酐、牛磺酸、多巴胺和5b-胆甾醇硫酸酯对分组贡献最大(P＜0.01)，可作为斑马鱼在氯吡嘧磺隆亚致死剂量胁迫下肝脏代谢异常的潜在标记物。

4 除草剂在斑马鱼体内的富集作用

生物富集研究对阐明农药在环境中的行为，评价和预测水环境中农药的慢性危害以及制定环境质量标准有十分重要的意义。但是除草剂在鱼体内的富集作用因除草剂种类及其暴露时间而异，即使是同一除草剂在鱼体内不同组织的富集程度也存在差异。Al-Sawafi等[12]将斑马鱼分别暴露在0.957、1.913 mg/L的莠去津药液中24 h，其最高富集系数分别为128 543和135 891；斑马鱼暴露在0.638 mg/L的莠去津药液中25 d，其最高富集系数为132 380，说明斑马鱼能迅速富集该除草剂。由此推测人体如长期接触该除草剂，健康将受到影响。张洪等[21]在水中加入氯吡嘧磺隆原药，分时间段采集样品，采用LC-MS测定水中和动物组织中的氯吡嘧磺隆以监测该药在斑马鱼组织器官中的分布，结果发现斑马鱼暴露在1 mg/L的氯吡嘧磺隆试验液中8 d后斑马鱼鳃、肌肉和肝脏中均含有氯吡嘧磺隆。氯吡嘧磺隆在斑马鱼组织中的含量大小依次为肝脏＞鳃＞肌肉。何健等[22]参照2甲4氯和2甲4氯异辛酯96 h的LC50合理设置暴露浓度进行富集试验，结果发现当斑马鱼暴露在0.5、5.0 mg/L的2甲4氯药液8 d后，BCF8d分别是1.82和1.61，而当斑马鱼暴露在10、50 μg/L的2甲4氯异辛酯药液8 d后，BCF8d分别是22.3、16.3，这说明除草剂2甲4氯和2甲4氯异辛酯在斑马鱼体内的富集分别属于低等到中等程度。邹积鑫等[23]把斑马鱼暴露在低浓度的乙羧氟草醚药液中8 d，发现当暴露浓度为0.03、0.30 mg/L时，第8 d的生物富集系数分别是1.16和2.43，说明斑马鱼对乙羧氟草醚的富集等级为低级。

5 结束语

随着化学除草剂使用量的增加，除草剂潜在的危害可能提早暴发，从而对水生生物造成意想不到的危害。为了降低除草剂对水生生物产生的危害以及对人类健康造成的潜在危害，建议加强除草剂对水生生物的毒性效应等方面的研究，以期为除草剂登记管理和合理使用提供科学数据。

[1] 于永利, 巴雅斯胡, 董武. 斑马鱼在农药安全评价中的应用[J]. 食品工程, 2013, (01)： 8—10.

[2] STRMAC M, BRAUNBECK T. Effects of triphenyltin acetate on survival, hatching success, and liver ultrastructure of early life stages of zebrafish (D. rerio)[J]. Ecotoxicol Environ Safety, 1999, 44(6)： 25—39.

[3] KIMMEL C B, BALLARD W W, KIMMEL S R, et al. Stages of embryonic development of the zebrafish[J]. Dev. Dyn, 1995, 203(3)： 253—310．

[4] VITOZZI L, DE ANGELIS G A. Critical review of comparative-acute toxicity data on freshwater [J]. AquatToxicol, 1991, 19(3)： 167—204．

[5] ENSENBACH U, NAGEL R. Toxicity of complex chemical mixtures：acute and long-term effects on different life stages zebrafish [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 1995, 30(2)： 151—157．

[6] 郑丽丽, 吴端生. 斑马鱼实验动物化研究及应用[J]. 南华大学学报(医学版), 2008, 36(2)：249—251.

[7] 胡竞进, 曹楚彦, 杨梅, 等. 乙草胺对斑马鱼幼鱼早期发育阶段甲状腺相关基因的影响[J]. 农药学学报, 2015, 17(4)： 409—416.

[8] CAO FANGJIE, LIU XIAOSHAN, WANG CHENGJU, et al. Acute and short-term developmental toxicity of cyhalofop-butyl to zebrafish (Danio rerio)[J].Environmental Science and Pollution Research, 2016, 23(10)： 10080—10089.

[9] 赵倩, 王灿灿, 袁旭娇, 等. 腐植酸影响扑草净对斑马鱼的急性毒性研究[J]. 农业环境科学学报, 2015, 34(4)： 653—659.

[10] YAN HAO, HUANG SUILIANG, SCHOLZ M. Kinetic processes of acute atrazine toxicity to Brachydaniorerio in the presence and absence of suspended Sediments [J]. Water, Air & Soil Pollution, 2015, 226(3)： 66—73.

[11] WIRBISKY S E, WEBER G J, SEPULVEDA M S, et al. An embryonic atrazine exposure results in reproductive dysfunction in adult zebrafish and morphological alterations in their offspring [J]. Scientific Reports, 2016, 6： 21337.

[12] AL-SAWAFI A. G. A, YAN YUNJUN. Bioconcentration and antioxidant status responses in zebrafish (Danio rerio) under atrazine exposure [J]. International Journal of Chemical Engineering and Applications, 2013, 4(4)： 204—208.

[13] PLHALOVA L, BLAHOVA J, MIKULIKOVA I, et al. Effects of subchronic exposure to atrazine on zebrafish (Danio rerio) [J]. Polish Journal of Veterinary Sciences, 2012, 15(3)： 417—423.

[14] OECD. Test No. 212： fish, short-term toxicity test on embryo and sac-fry stages[J]. Guideline for Testing of Chemicals, 2006, 1(2)： 1—20.

[15] HILL AJ, TERAOKA H, HEIDEMAN W, et al. Zebra fish as model vertebrate for investigating chemical toxicity[J]. ToxicolSci, 2005, 86(1)： 6—19.

[16] 刘迎, 胡燕, 姜蕾, 等. 5种酰胺类除草剂对斑马鱼胚胎发育的毒性效应[J]. 农药, 2014, 53(11)： 806—808, 811.

[17] XU CHAO, TUWENQING, DENG MI, et al. Stereoselective induction of developmental toxicity and immunotoxicity by acetochlor in the early life stage of zebrafish [J]. Chemosphere, 2016, 164： 618—626.

[18] ROY N M, OCHS J, ZAMBRZYCKA E, et al. Glyphosate induces cardiovascular toxicity in Danio rerio [J]. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2016, 46： 292—300.

[19] ZHU LIZHEN, MU XIYAN, WANG KAI, et al. Cyhalofop-butyl has the potential to induce developmental toxicity, oxidative stress and apoptosis in early life stage of zebrafish (Danio rerio)[J]. Environmental Pollution, 2015, 203： 40—49.

[20] 张洪, 何建昇, 康乐, 等. 氯吡嘧磺隆在水中的残留动态及其在斑马鱼组织中的分布[J]. 环境化学, 2015, 34(9)： 1774—1776.

[21] 张洪, 赵丽娟, 刘慧平, 等. 亚致死剂量氯吡嘧磺隆胁迫对斑马鱼肝脏代谢物的影响[J/OL]. 环境科学学报, http：//www.cnki.net/ kcms/detail/11.1843.X.20160919.0844.001.html.

[22] 何健, 周艳, 孔德洋, 等. 2甲4氯和2甲4氯异辛酯在斑马鱼体内生物富集性[J]. 农药, 2015, 11： 822—824.

[23] 邹积鑫, 何雄奎, 陶传江, 等. 乙羧氟草醚对斑马鱼的急性毒性和生物富集性研究[J]. 农药学学报, 2006, (04)： 375—378.

A review on Toxicological Effect of Herbicides to Zebrafish

YUAN Gui-ping1, CHEN Jing-yu1, JIN Chen-zhong1, OU Xiao-ming1,2, TAN Xian-sheng1
(1.Collaborative Innovation Center for Farmland Weeds Control Technology and Application, Hunan University of
Humanities, Science and Technology, Hunan, Loudi 417000, China; 2.National Engineering Center for
Agrochemicals, Hunan Research Institute of Chemical Industry, Changsha 410014, China)

Frequent and unreasonable use of herbicides may cause serious pollution of water bodies, thereby threatening the survival of aquatic life and human health, so more and more researchers began to carry out risk evaluation for the ecological environment of herbicides. Zebrafish is one of the internationally recognized model vertebrates with the unique advantages and is one of the best materials for risk assessment of contaminants. The role of zebrafish in the risk assessment, acute and chronic toxicity of herbicides to zebrafish and its embryos and bioaccumulation were reviewed in this paper.

herbicide; zebrafish; toxicity

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2016.06.07

TQ450

：A

1009-6485(2016)06-0033-04

湖南省高校创新平台开放基金项目(15K066)、湖南省产业化培育项目(13CY030)

袁桂平(1992—)男，湖南衡阳人，在读硕士生，研究方向：农药生态毒理学。

*欧晓明，E-mail： xmouhn@163.com。

2016-11-04。