川芎嗪对钳夹子宫血管致胎鼠生长受限的影响

陈建清



川芎嗪对钳夹子宫血管致胎鼠生长受限的影响

陈建清

目的探讨川芎嗪对钳夹子宫血管致胎鼠生长受限的影响。方法取SD雌性大鼠60只，受孕后将其分为对照组、模型组、低剂量组以及高剂量组，每组各15只，在孕14d时采用钳夹子宫血管的方法造模，对照组仅开腹而不钳夹子宫，低剂量组给予川芎嗪40 mg/kg，高剂量组给予川芎嗪80 mg/kg，孕21d，取其胎鼠测量体质量、脑质量，并比较各组胎鼠脑组织GAP-43水平、海马GAP-43 mRNA、NSE mRNA表达水平。结果造模后各组胎鼠体质量、脑质量较对照组明显降低(P<0.05)，FGR发生率明显增高(P<0.05)，而运用川芎嗪注射液能够明显改善胎鼠体质量、脑质量以及FGR发生率(P<0.05)，且高剂量组改善情况明显优于低剂量组(P<0.05)。结论钳夹子宫血管能够导致FGR胎鼠发生率增加，而采用川芎嗪干预则能够有效改善FGR胎鼠的生长发育状况。

川芎嗪；钳夹子宫；生长发育；GAP-43；NSE

胎儿宫内生长受限(fetal growth restriction, FGR)是临床产科当中的一种重要的并发症，此类胎儿不仅在宫内的生长发育受到限制，常常还伴有着胎儿神经系统方面的损害[1]。在临床工作中，对于FGR胎儿主要采用支持疗法以及药物疗法，但是其治疗的临床疗效却不甚理想。有相关药物学实验研究表明[2]，川芎嗪作为一种新型的钙离子拮抗剂，具有加强扩张动脉血管、改善机体微循环的作用，同时也有研究显示[3，4]，川芎嗪对于FGR胎鼠具有脑组织保护作用，其作用机制的研究主要集中在神经生长相关蛋白GAP-43方面。本研究探讨分析川芎嗪对钳夹子宫血管所致FGR幼鼠生长发育的影响及其对GAP-43、神经元烯醇化酶NSE的影响，现将结果报道如下。

1　材料与方法

1.1实验动物选择SD雌性大鼠60只，60只大鼠均为健康成年大鼠，且均无交配史，大鼠体质量在200～250 g之间；再选择成熟健康的雄性SD大鼠10只。以上大鼠均购于重庆国家生物产业基地实验动物中心。大鼠均使用标准颗粒料进行喂养，不限制大鼠的饮食以及饮水，保持动物房相对湿度为22%，室温22℃。

1.2试剂川芎嗪注射液购于西安汉丰药业有限责任公司(H61023181)，GAP-43免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司，mRNA PCR KIT购于宝生物功能(大连)有限公司，总RNA提取试剂盒以及mRNA提取试剂盒均购于上海朗顿生物科技有限公司。引物有上海生工工程有限公司合成，其引物序列见表1。

表1　各基因引物序列及扩增片段长度

1.3分组及造模

1.3.1妊娠及分组分别将6只雌鼠与1只雄鼠合笼，与次日清晨进行阴道涂片检查，若发现阴栓或者精子则将其确定为妊娠，并作为妊娠第0天。按照雌鼠受孕的先后顺序进行编号，然后将其随机分为模型组、低剂量组、高剂量组以及对照组，每组15只雌鼠。

1.3.2手术方法大鼠妊娠后14d，按照3 ml/kg体质量使用20%水合氯醛腹腔注射麻醉，剪开大鼠腹部后暴露大鼠双侧的子宫动脉，使用微小动脉血管夹钳将大鼠双侧子宫卵巢动静脉以及子宫动静脉进行钳夹，使得双侧弓状血管的全部血液来源暂时阻断，从而造成胎鼠缺血。钳夹30 min之后取下血管钳，恢复子宫的血供，待子宫卵巢颜色转红之后还纳子宫，然后关闭腹腔。

1.3.3实验分组及用药高剂量组：于开腹前30 min给予大鼠80 mg/kg川芎嗪腹腔注射，手术完成关腹后30 min再次给予80 mg/kg川芎嗪腹腔注射，术后每隔24 h注射一次，直至大鼠妊娠至21d。低剂量组：川芎嗪注射方法同高剂量组，其注射剂量为40 mg/kg。模型组：按照上述注射时间，给予大鼠等体积的生理盐水腹腔注射。对照组：大鼠开腹后不进行子宫钳夹，其余步骤与模型组相同。

1.4实验方法孕21d时，使用20%水合氯醛腹腔注射麻醉，剖腹取出其腹中胎鼠，每胎胎鼠均随机取四只当天处死，当天处死胎鼠取出脑组织后用滤纸将羊水以及血液洗干净，然后称重，再采用断头法将其处死，对其肝脑组织称重。

上述处死的胎鼠称重后取其脑组织，一半采用免疫组织化学染色方法进行GAP-43蛋白表达的测定，将其脑组织置于10%甲醛溶液当中固定48h，然后做脑正中矢状切，常规方法制备大鼠脑组织石蜡切片。常规脱蜡水化之后热修复抗原，加入正常的血清使之封闭半小时，然后加入适量稀释的GAP-43，在4℃条件下过夜。然后使用PBS清洗，再加入山羊抗小鼠IgG，在37℃条件下孵育30 min，再用PBS清洗3次，滴加SABC，在37℃条件下放置30 min，再用PBS清洗3次，使用DAB显色，然后用苏木素复染、脱水、透明、最后封片。

上述处死的另一半胎鼠，采用RT-PCR技术测定海马中GAP-43、NSE基因的mRNA表达量，处死幼鼠后，迅速分离其大脑海马组织，然后置于-80℃冰箱内待测。提取海马组织中的总RNA，通过紫外检测RNA浓度，然后根据不同RNA浓度确定PCR所需模板量，保持各样品加入量一致。PCR反应条件为：96℃3min，85℃1min，55℃30s、71℃1min、72℃5min，共进行30个循环，然后取10μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。使用NSE以及GAP-43与β-actin的恢度比值表示NSE mRNA以及GAP-43 mRNA的表达水平。

2　结果

2.1胎鼠体质量、脑质量以及FGR发生率比较各组胎鼠体质量、脑质量以及FGR的发生率比较，模型组、低剂量组以及高剂量组胎鼠其体质量、脑质量较对照组显著降低(P<0.05)，而FGR发生率较对照组显著升高(P<0.05)；低剂量组以及高剂量组胎鼠其体质量、脑质量较模型组显著升高(P<0.05)，而FGR发生率较模型组显著降低(P<0.05)；高剂量组胎鼠体质量、脑质量较低剂量组显著升高(P<0.05)，而FGR发生率较低剂量组显著降低(P<0.05)。见表2。

表2　各组胎鼠的体质量、脑质量以及FGR的发生率比较结果

注：与对照组比较，1)P<0.05；与模型组比较2)P<0.05；与低剂量组比较，3)P<0.05

2.2免疫组化检测GAP-43表达各组大鼠免疫组化检测GAP-43蛋白光度密度值比较，模型组、低剂量组以及高剂量组与对照组比较，GAP-43表达量明显降低(P<0.05)；低剂量组与模型组比较，GAP-43表达量无统计学差异(P>0.05)；高剂量组与模型组、低剂量组比较，GAP-43表达量显著升高(P<0.05)。见表3。

表3　免疫组化检测各组GAP-43蛋白光度密度值

注：与对照组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05；与低剂量组比较，3)P<0.05

2.3各组胎鼠海马GAP-43以及NSE mRNA相对表达量各组胎鼠海马GAP-43以及NSE mRNA相对表达量，模型组、低剂量组以及高剂量组GAP-43 mRNA相对表达量较对照组显著降低(P<0.05)；模型组以及低剂量组之间GAP-43 mRNA相对表达量无显著性差异(P>0.05)；高剂量组GAP-43 mRNA相对表达量较低剂量组、模型组显著增加(P<0.05)；模型组、低剂量组以及高剂量组NSE mRNA相对表达量较对照组显著升高(P<0.05)；模型组以及低剂量组之间NSE mRNA相对表达量无显著性差异(P>0.05)；高剂量组NSE mRNA相对表达量较低剂量组、模型组显著降低(P<0.05)。见表4。

表4　各组胎鼠海马GAP-43以及NSE mRNA相对表达量

注：与对照组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05；与低剂量组比较，3)P<0.05

3　讨论

川芎嗪是从我国传统活血化瘀、理气中药川芎当中提取出来的一种主要有效成分，其化学结构为四甲基吡嗪[5]，根据相关药理学研究结果显示[6]，川芎嗪能够有效扩张动脉血管，改善机体的微循环，并且对于缺氧缺血性脑损伤具有着良好的神经保护作用。在本次研究中，造模后各组胎鼠体质量、脑质量较对照组明显降低(P<0.05)，FGR发生率明显增高(P<0.05)，而运用川芎嗪注射液能够明显改善胎鼠体质量、脑质量以及FGR发生率(P<0.05)，且高剂量组改善情况明显优于低剂量组(P<0.05)。表明采用钳夹子宫的方式确实能够造成胎鼠出现体质量、脑质量下降，增加胎鼠FGR的发生率，使用川芎嗪干预之后，能够有效降低由于钳夹子宫造成了胎鼠生长发育受限，增加胎鼠的体质量、脑质量，并且降低胎鼠发生FGR的概率，以高剂量组川芎嗪干预效果更佳，这与国内洪莹研究结果相似[7]。

神经生长相关蛋白GAP-43是一种主要存在于分化定性并开始轴突生长的神经元当中的钙离子依赖酸性快速转移膜蛋白，GAP-43在机体脑功能的活跃阶段其大脑表达量最高，与大脑的生长发育、神经元的分化以及神经的某些基础功能有着非常密切的关系。在本研究中，对胎鼠大脑切片进行免疫组织化学检验，其结果显示，模型组、低剂量组以及高剂量组与对照组比较，GAP-43表达量明显降低(P<0.05)；低剂量组与模型组比较，GAP-43表达量无统计学差异(P>0.05)；高剂量组与模型组、低剂量组比较，GAP-43表达量显著升高(P<0.05)。表明了钳夹子宫造模之后，胎鼠的脑组织GAP-43表达量出现明显下降，同样证实造模后FGR幼鼠其大脑发育受到损伤，而通过川芎嗪干预后，低剂量组其脑组织GAP-43表达无明显变化，而高剂量组胎鼠其脑组织GAP-43的表达则出现明显的升高，表明了川芎嗪对于FGR胎鼠的脑组织具有一定的损伤保护作用。

海马是大脑当中非常活跃的一个区域，其大脑海马当中富含有大量的GAP-43，并且在机体中枢神经学习记忆中起到非常重要的作用，但是有研究结果显示，海马中的GAP-43容易受脑组织损伤的影响[8]。在本次研究中，针对胎鼠海马区GAP-43采用RT-PCR技术检测其GAP-43 mRNA的表达情况，结果显示，模型组、低剂量组以及高剂量组GAP-43 mRNA相对表达量较对照组显著降低(P<0.05)；模型组以及低剂量组之间GAP-43 mRNA相对表达量无显著性差异(P>0.05)；高剂量组GAP-43 mRNA相对表达量较低剂量组、模型组显著增加(P<0.05)。表明了钳夹子宫造模之后，胎鼠海马区GAP-43 mRNA表达水平显著降低，采取低剂量川芎嗪干预，其海马区GAP-43 mRNA表达水平无显著变化，而采取高剂量川芎嗪干预后[9]，其海马区GAP-43 mRNA表达水平出现显著升高。

神经元烯醇化酶NSE脑缺血的一种敏感标志物，国外学者Lamers等人研究发现，围产期新生儿血清NSE水平显著升高是新生儿窒息之后发生严重脑低氧-缺氧损伤的一个敏感性指标。因此NSE水平与机体神经元的发育、分化以及神经系统的损伤之间具有非常密切的关系。在本研究中，检测胎鼠海马区NSE mRNA表达水平的变化情况，其结果显示，模型组、低剂量组以及高剂量组NSE mRNA相对表达量较对照组显著升高(P<0.05)；模型组以及低剂量组之间NSE mRNA相对表达量无显著性差异(P>0.05)；高剂量组NSE mRNA相对表达量较低剂量组、模型组显著降低(P<0.05)。提示了FGR胎鼠造模之后，其海马区NSE mRNA表达量增高，胎鼠出现一定程度的神经系统损伤，而通过高剂量川芎嗪干预之后，能够显著降低胎鼠海马区NSE mRNA的表达水平。

由以上结果来看，川芎嗪能够改善钳夹子宫血管所致的FGR胎鼠生长发育受限，同时升高GAP-43水平、降低NSE水平，其可能的作用机制为[10]：①川芎嗪能够有效改善机体的微循环功能，从而能够扩张孕鼠的子宫动脉，进而有效增加孕鼠胎盘中的血流量，改善由于钳夹子宫血管而造成的胎鼠缺血缺氧症状；②有研究显示[11]，川芎嗪能够有效增加机体红细胞的变形作用，提高SOD活性，抑制机体内脂质过氧化物的产生，改善子宫内环境，从而能够起到促进胎鼠生长的作用。

综上所述，钳夹子宫血管能够导致FGR胎鼠发生率增加，而采用川芎嗪干预则能够有效改善FGR胎鼠的生长发育状况，提高胎鼠脑组织以及海马区GAP-43表达水平，降低海马区NSE表达水平，从而对FGR胎鼠起到神经保护作用，且疗效与川穹嗪使用剂量相关。

[1]淡敏,艾红,韩蓁等.胎儿宫内生长受限颅内静脉血流的改变[J].中国超声医学杂志, 2014, 30(7): 635-638.

[2]梁爱群.川芎嗪的药理及机理研究[J].时珍国医国药,2005,16(6):532-533.

[3]纳鑫,汪雪兰,皮荣标，等.川芎嗪对中枢神经系统的药理作用及其机制的研究进展[J].中药新药与临床药理,2008,19(1):77-80.

[4]杨雪梅.川芎嗪药理作用研究进展[J].中国生化药物杂志,2010,31(3):215-217.

[5]Yoo S, Kim H H, Kim P, et al. A HuD-ZBP1 ribonucleoprotein complex localizes GAP‐43 mRNA into axons through its 3′ untranslated region AU-rich regulatory element[J]. Journal of neurochemistry, 2013, 126(6): 792-804.

[6]Donnelly C J, Park M, Spillane M, et al. Axonally synthesized β-actin and GAP-43 proteins support distinct modes of axonal growth[J]. The Journal of Neuroscience, 2013, 33(8): 3311-3322.

[7]洪莹, 王燕, 张元珍, 等. 川芎嗪对宫内生长受限幼鼠生长发育及脑损伤 GAP-43 蛋白表达的影响[J]. 武汉大学学报: 医学版, 2007, 28(2): 143-146.

[8]张蕾.中药熏蒸治疗不随意运动型小儿脑瘫的临床观察[J]. 光明中医，2009，24(3)：484-485.

[9]侯光宝.川芎嗪注射液治疗脑梗死70例[J].光明中医,2010，25(7):1198.

[10]吴晋,陈益君,黄长顺，等.川芎嗪对老年患者体外循环心脏手术炎性反应及术后认知功能的影响[J].中国全科医学,2014,17(11):1262-1265.

[11]李豪英.未破裂卵泡黄素化综合征临证通络八法[J].光明中医2006，21(10)：60-61.

火麻仁饮片

炮制：火麻仁 除去杂质及果皮。

性味：甘，平。

归经：归脾、胃、大肠经。

功能：润肠通便。

主治：用于血虚津亏，肠燥便秘。

用法与用量：10～15g。

贮藏：置阴凉干燥处，防热，防蛀。

——《中华人民共和国药典》一部2010版

Effect of TMP on Uterine Vessels Clamping Induced Growth Retardation of Fetal Rat

CHEN Jianqing

(Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fujian, Fuzhou 350004, China)

ObjectiveTo investigate the effect of TMP on uterine vessels clamping induced growth retardation of fetal rat. Methods60 SD female pregnant rats were divided into control group, model group, low dose group and high dose group, and each group had 15 rats. At 14d, the model was made by the method of uterine vascular clamping. The control group onlyP<0.05), FGR were significantly higher (P<0.05). The use of TMP injection can significantly improve fetal rats body weight, brain weight and FGR incidence (P<0.05), and the improvement if the high-dose group was better than that of the low-dose group (P<0.05). ConclusionUterine vessels clamping can lead to increased incidence of FGR, while the use of TMP intervention can improve the growth and development of FGR fetuses.

laparotomy. The low dose group was given TMP 40mg / kg. The high dose group was given TMP 80mg / kg. At 21d, fetuses were measured body weight and brain weight. The GAP-43 levels in brain tissue, hippocampus GAP-43 mRNA, NSE mRNA expression levels of fetal rats in each group were compared. ResultsAfter modeling, the fetal rats body weight and brain weight of the model group, the low dose group and the high dose group was significantly lower than those the control group (

TMP; Clamping uterus; Growth; GAP-43; NSE

福建医科大学附属第一医院药学部(福建 350004)

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.07.020

1003-8914(2016)-07-0946-04

(本文校对：林功舟2015-07-15)