脊髓背角神经元上调Nav1.8通道参与缺血再灌注损伤后痛觉过敏的机制

李晓倩，张再莉，马　虹



脊髓背角神经元上调Nav1.8通道参与缺血再灌注损伤后痛觉过敏的机制

李晓倩，张再莉，马虹*

中国医科大学附属第一医院麻醉科，沈阳 110001

[摘要]目的观察鞘内注射钠通道抑制剂619C89对脊髓缺血再灌注损伤引起的痛觉过敏大鼠的痛阈、脊髓背角神经元中Nav1.8通道表达的影响。方法SD大鼠随机分为3组：假手术组(S组)、痛觉过敏组(H组，缺血再灌注前3 d鞘内注射30 μL生理盐水)、钠通道抑制剂组(I组，缺血再灌注前3 d鞘内注射619C89 5 μg/30 μL)。S组仅暴露主动脉弓而不结扎，其他各组开胸后无创动脉夹夹闭主动脉弓14 min后再开放，建立SCIRI引起的痛觉过敏模型。各组手术前均于L5-6鞘内置管并连续注射3 d。术后1、3、5、7、14 d分别测定各组大鼠的热痛阈及机械性痛阈；取第4～6节腰段脊髓，采用免疫双荧光法观察背角神经元状态及其Nav1.8的表达，Real time-PCR法检测各组大鼠脊髓组织Nav1.8表达。结果与S组相比，术后各观察点(尤以第7天为著)H组大鼠热痛阈和机械性痛阈降低，损伤后7 d脊髓组织中Nav1.8 mRNA的表达增加(P<0.05)；I组大鼠热痛阈和机械性痛阈值明显提高(P<0.05)，脊髓组织中Nav1.8 mRNA的表达降低(P<0.05)。免疫双荧光染色显示，损伤后7 d，H组大鼠脊髓背角Nav1.8的荧光强度明显增加，且主要表达在NeuN表达阳性的神经元的胞浆中；且与S组相比，H组中NeuN/Nav1.8双阳性的细胞数量明显增多，而I组双阳性的细胞数量减少(P<0.05)。结论脊髓背角神经元通过上调Nav1.8通道参与缺血再灌注损伤后痛觉过敏的形成。

[关键词]痛觉过敏；神经元；钠通道抑制剂;Nav1.8通道

0　引言

痛觉过敏(Hyperalgesia)是指伤害性刺激下，在受损部位及周围或远处可产生各种敏感性增强的疼痛或痛觉过敏区域，引起的更加强烈的疼痛，是外周和中枢敏感化的结果[1]。调查发现，近50%的人曾遭受不同程度痛觉过敏的影响，严重影响患者生活质量、加重社会负担。痛觉过敏的发生机制非常复杂，主要与伤害性感受神经元的电活动形成有关。进一步研究表明，初级痛觉过敏主要是由于外周受损部位神经末梢伤害性感受器不断受到刺激产生，而二级痛觉过敏与神经中枢尤其是脊髓神经元兴奋性发生的改变有关[2]。研究发现，河豚毒素不敏感(TTX-R)的Nav1.8通道专一表达在外周感觉神经元上，可以产生慢失活TTX-R钠电流，是所在细胞动作电位去极化期的钠电流的主要通道。炎症痛模型中发现，小鼠背根神经节(Dorsal root ganglia，DRG)神经元中Nav1.8通道表达上调、TTX-R钠电流明显增加[3-4]。此外，通过遗传学的方法敲除小鼠Nav1.8基因后，小鼠对伤害性机械性刺激表现出明显的痛觉缺失[5]。因此，Nav1.8在疼痛通路特别是在外周敏化的作用是痛觉过敏机制的研究热点。目前对脊髓缺血再灌注损伤(Spinal cord ischemia reperfusion injury,SC IRI)后引起的疼痛过敏模型中电压门控性钠通道表达调节的相关研究还罕见报道。本研究拟通过观察鞘内注射钠通道抑制剂619C89[4氨基2(4甲基1哌嗪)5(2,3,5三氯苯基)嘧啶]对IRI致痛觉过敏的镇痛作用，并探讨Nav1.8表达在脊髓背角神经元中的作用。

1　材料和方法

1.1仪器和试药雄性Sprague-Dawley大鼠90只，体重260～280 g；619C89(江苏倍达医药科技有限公司)；兔抗大鼠NeuN单克隆抗体，小鼠抗大鼠Nav1.8多克隆抗体、Alexa Fluor 488标记的驴抗兔IgG抗体、Alexa Fluor594标记的驴抗小鼠IgG抗体(Abcam公司)；one step RT-PCR试剂盒(大连宝生物公司)；鼠爪机械痛阈测定仪(型号:3740,UGO BASILE公司,意大利);大鼠爪热痛阈测定(型号:7370,UGO BASILE公司，意大利)；图像分析系统(武汉华海公司，HIPAS-1000型)；酶标仪(美国BIO-TEK公司，EIx800型)由中国医科大学附属第一医院中心实验动物中心提供。

1.2实验方法

1.2.1实验分组大鼠随机分为3组，每组30只。非假手术组参照文献[6]制备损伤后痛觉过敏模型，并行L5-6鞘内置管。假手术组(S组):损伤前3 d鞘内注射生理盐水30 μL，开胸并暴露主动脉弓而不阻断；H组：损伤前3 d鞘内注射生理盐水30 μL，开胸暴露主动脉弓并用无创动脉夹夹闭14 min后开放；I组：损伤前3 d鞘内注射10 μg 619C89 (30 μL)，其余同H组。

1.2.2缺血再灌注损伤后痛觉过敏模型的建立[6]水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，常规消毒，右侧卧位，四肢固定于手术台上，胸背部去毛，消毒铺巾。沿肋缘切口逐层分离并暴露左肺上叶，面纱条肺部保护后由心包处开始分离主动脉，至主动脉弓左锁骨上动脉发出处上无创动脉夹夹闭14 min，后撤除动脉夹，逐层缝合伤口。腹腔注射0.3 mL氨苄青霉素(100 mg/mL)。术后单笼饲养。

1.2.3机械性痛阈及热痛阈测定参照Obata等[7]方法，分别于CCI前2 d及术后1、3、5、7、14 d，采用电子自动爪触觉测试仪测定各组大鼠右足机械刺激缩爪阈值(Paw withdrawal threshold，PWT)。照射内侧第1足趾的着力点，采用辐射热测痛仪测定各组大鼠右足辐射热刺激缩爪潜伏期(Paw withdrawal latency，PWL)，单次照射不超过20 s，以免损伤照射部位。测定值精确到0.1 s。各时点各指标分别测定3次，每次间隔5 min，取平均值。

1.2.4免疫双荧光法观察大鼠脊髓背角神经元和Nav1.8分布脊髓组织固定和浸糖，冰冻连续切片(厚度为20 μm)后放入含1%胎牛血清和0.3% Triton X-100的PBS室温封闭30 min。分别加入兔抗大鼠NeuN(1∶300)和小鼠抗大鼠Nav1.8(1∶500)的一抗孵育过夜，冲洗后加入Alexa Fluor 488标记的驴抗兔IgG(1∶800)和Alexa Fluor 594标记的驴抗小鼠IgG的二抗，室温避光孵育2 h。封固后用激光扫描共聚焦显微镜观察，Image Pro Plus 6.0软件计数，取3个平面计数平均值。

1.2.5Real time-PCR测定大鼠脊髓组织中Nav1.8 mRNA的表达按试剂盒说明书操作。通过1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度仪检测提取总RNA的质量和浓度。在NCBI数据库中查询Nav1.8、NeuN和GAPDH序列，设计与合成引物。引物序列如下:Nav1.8(正向):5′-CAGAAGGAACAGGAGGTG-3′,(反向)：5′-GAAGCTCTYCT GCCCTGTAGT-3′；GAPDH(正向)5′-TCGGCATTGTGGAGGGGCTC-3′，(反向)5′-TCCCGTTCAGCTCGGGGATG-3′。在FTC2000型荧光定量PCR仪上行PCR。扩增条件如下：①94 ℃ 1 min，②94 ℃ 10 s，③55 ℃ 30 s，④72 ℃ 1 min，45个循环。退火期为55 ℃ 30 s。结束后，系统根据各反应管的荧光强度增长指数(DRn)绘制扩增动力学曲线和确定至特定阈值时的扩增循环数(Ct值)，采用2-△△CT法处理数据。

2　结果

2.1大鼠机械性痛阈及热痛阈的变化与S组相比，术后各观察点(尤以第7天为著)H组大鼠右足PWT值和PWL值明显降低(P<0.05)；与H组相比，I组术后各观察点PWT值和PWL值明显升高(P<0.05)，见图1、图2。

图1　缺血再灌注损伤后第1、3、5、7、14 d大鼠右足机械刺激缩爪阈值(PWT)变化

图2　缺血再灌注损伤后第1、3、5、7、14 d大鼠右足热刺激缩爪潜伏期(PWL)变化

2.2免疫双荧光观察大鼠脊髓背角神经元及Nav1.8通道变化NeuN作为神经元特异性标记物，与S组相比，损伤后7 d镜下可见，H组大鼠脊髓背角Nav1.8的荧光强度(红色)明显增加，且主要表达在NeuN表达阳性的神经元的胞浆中(绿色)，黄色部分即Nav1.8和NeuN重叠的部分，定量后可见Nav1.8/NeuN双标阳性细胞的数量明显增加(P<0.05)；与H组相比，I组损伤后Nav1.8和NeuN荧光强度明显降低，且Nav1.8/NeuN双标阳性细胞的数量也明显减少(P<0.05)，见图3。

图3　缺血再灌注损伤后第7天大鼠脊髓背角神经元与Nav1.8通道变化及Nav1.8/NeuN双标阳性细胞计数

2.3大鼠脊髓组织Nav1.8 mRNA表达的变化RT-PCR结果显示:与S组相比，术后各观察点H组大鼠脊髓组织中Nav1.8 mRNA表达均增高，尤以第7天为著(P<0.05)；与H组相比，I组大鼠脊髓组织中Nav1.8 mRNA表达在术后明显下降(P<0.05)，见表1。

3　讨论

SCIRI临床常见于脊柱手术、血管畸形以及心脏手术体外循环期间等，以损伤平面以下感觉功能异常和运动功能缺失最为常见，且后果严重，给患者带来巨大的痛苦和社会负担[6,8]。本研究采用无创动脉夹夹闭14 min后再开放模拟缺血再灌注过程，术后2周内大鼠双下肢出现了明显的自发性疼痛(缩足现象)、不敢着地以及明显的触诱发痛和热痛敏，而未现下肢瘫痪和感染等征象，标志着术后痛觉过敏的成功建立。

表1　各时间点脊髓组织Nav1.8 mRNA表达

注：与S组比较，*P<0.05；与H组比较，#P<0.05

关于痛觉过敏的发生机制非常复杂，通常认为与神经元异常电活动形成有关[2]。随着研究的深入，发现外周感觉神经元上特异性表达Nav1.8钠通道，在神经损伤后可以产生慢失活河豚毒素不敏感(TTX-R)钠电流，诱发动作电位产生，进而诱发痛觉过敏[9-10]。Lai等[11]采用鞘内连续注射反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide，AMO)的方法成功缓解损伤后3 d大鼠术侧痛觉过敏的症状，但在术后5 d没有明显治疗作用。这可能与AMO易被机体消化酶分解，且只有足量的AMO进入靶细胞才能发挥有效的调节作用有关，因此限制了AMO对长期痛觉过敏的治疗作用。而基因敲除的方法虽可有效缓解实验动物的痛觉缺失[5]，但目前尚无在人体中应用的先例。因此，选择有效的抑制钠通路的药物对治疗和预防痛觉过敏至关重要。

既往研究发现，钠通道抑制剂619C89[4氨基2(4甲基1哌嗪)5(2,3,5三氯苯基)嘧啶通过影响损伤神经轴突区钠通道异常堆积[12-13]，限制神经末梢突触前的谷氨酸和天冬氨酸释放，减轻卒中患者脑水肿[14]。因此，本研究通过观察鞘内注射619C89对缺血再灌注损伤后引起的痛觉过敏大鼠的热痛阈和机械痛阈的影响，探讨脊髓背角神经元中Nav1.8表达在其中的作用。同样，在本实验中，损伤前3 d鞘内连续注射619C89能够明显提高大鼠双足PWL值和PWT值，证实抑制钠通道可以明确减轻神经元反复、异常的电活动所引起痛觉过敏。本实验中PWT值和PWL值在术后7 d变化最明显，因此本实验进一步选择损伤后第7天观察脊髓背角病理学变化和对脊髓组织中Nav1.8 mRNA表达的影响。免疫荧光技术是近年来最常用的直接显示和检查细胞或组织内是否存在目的抗原或半抗原的实验手段[6,8]。本实验采用荧光双染的方法通过观察神经元与Nav1.8在脊髓背角是否存在一致性分布，确认两者间的内在联系。NeuN作为神经元特异性标记物，痛觉过敏后镜下可见大鼠脊髓背角中神经元的胞体明显增大，荧光强度(绿色)增加，同时，脊髓背角中Nav1.8的荧光强度(红色)明显增加，且Nav1.8主要表达在NeuN表达阳性的神经元胞浆中，即黄色重叠部分。定量分析结果显示，给予钠通道抑制剂可以明显减少痛觉过敏引起的Nav1.8/NeuN双标阳性细胞的数量增加，由此推测Nav1.8参与了痛觉过敏中神经元的激活。同时使用PCR法检测术后第1、3、5、7、14天脊髓组织中Nav1.8 mRNA的表达变化，结果显示，在各时间点H组Nav1.8 mRNA含量明显高于S组，与PWT值和PWL值呈负相关，进一步证实脊髓背角神经通过上调Nav1.8参与痛觉过敏的形成，与Li等[15-16]的研究结果一致。

综上所述，本研究通过观察鞘内注射钠通道抑制剂619C89对缺血再灌注损伤后痛觉过敏大鼠痛阈和脊髓病理学变化的影响，证实脊髓背角神经元Nav1.8参与痛觉过敏的发生和发展，为临床治疗神经病理性疼痛提供了新的治疗靶点。

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收稿日期：2016-01-27

基金项目：辽宁省科学技术计划项目(2012408002)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201607003

Mechanisms of ischemia-reperfusion induced hyperalgesia via up-regulation of neuronal Nav1.8 channel in spinal dorsal horn

LI Xiao-qian,ZHANG Zai-li,MA Hong*

(Department of Anesthesiology,the First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effects of intrathecal injection (IT) of Nav1.8 channel inhibitor 619C89 on hyperalgesia and spinal cord levels of neuronal Nav1.8 expressions in rat model of spinal cord ischemia-reperfusion injury (SCIRI).MethodsMale Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups:group S,group H (SCIRI+IT NS) and Nav1.8 channel inhibitor group (group I,SCIRI+IT 5 μg/30 μL 619C89).The lumbar intrathecal catheters were implanted in L5-6of rats and SCIRI models were established by aortic arch occlusion for 14 min.The thermal and mechanical nociceptive thresholds were assessed by paw withdrawal latency (PWL) to radiant heat and von Frey filaments.The 619C89 was administered intrathecally for 3 days before surgery.The spinal mRNA expression of Nav1.8 was assessed by Real time-PCR and double immunofluorescence staining was performed for examination of the distribution of neurons and Nav1.8 and also quantification of NeuN/Nav1.8 positive cells of dorsal horn at 1,3,5,7 and 14 days after surgery. ResultsCompared with group S,animals in group H had significantly lower mechanical and thermal pain thresholds,but higher spinal mRNA expression of Nav1.8 (P<0.05).Rats in group I had significantly higher mechanical and thermal pain thresholds and significantly lower mRNA expression of Nav1.8 compared with those in group H (at any observed time points after IR,but most significantly at 7 days,P<0.05).Double fluorescent staining showed the distribution of increased fluorescence intensity of Nav1.8 was similar to that of fluorescent staining of NeuN (neuronal marker).The number of NeuN/Nav1.8 positive cells was greatly increased in group H,whereas the number was obviously decreased in group I (P<0.05).ConclusionUp-regulation of neuronal Nav1.8 channel in spinal dorsal horn plays a role in IR-induced hyperalgesia.

Key words：Hyperalgesia;Neuron;Na channel inhibitor;Nav1.8 channel