长梗秦艽酮对吉西他滨耐药肺癌H1975细胞的抑制作用及其机制研究

张　毅，徐小嫚，张　萌，何　平*



长梗秦艽酮对吉西他滨耐药肺癌H1975细胞的抑制作用及其机制研究

张毅a，徐小嫚b，张萌a，何平a*

中国医科大学附属盛京医院 a.干诊科，b. 第一呼吸内科，沈阳 110004

[摘要]目的探讨天然化合物长梗秦艽酮对吉西他滨耐药肺腺癌细胞H1975增殖、凋亡的影响及其可能机制。方法采用MTT比色法检测长梗秦艽酮对H1975细胞增殖的影响；采用AnnexinV/PI流式细胞仪双染法检测长梗秦艽酮诱导H1975细胞凋亡；通过荧光电子显微镜观察长梗秦艽酮诱导凋亡的细胞核形态变化；通过Western blot研究长梗秦艽酮发挥抑癌作用的靶蛋白及机制。结果长梗秦艽酮显著抑制肺癌细胞H1975的增殖，且呈现明显时间剂量依赖性；长梗秦艽酮可以诱导细胞凋亡；长梗秦艽酮处理使细胞出现染色质边集、核碎裂等典型的细胞凋亡改变；长梗秦艽酮处理使Bcl-2表达降低，Bax表达升高。结论长梗秦艽酮可以抑制H1975细胞增殖，通过对Bcl-2和Bax的调节诱导细胞凋亡，是一种潜在的天然抗肿瘤药物。

[关键词]长梗秦艽酮；肺癌；增殖；凋亡

0　引言

近年来，中药抗肿瘤作用越来越受到关注，大量中药复方及天然单体成分在实验和临床研究中被证实具有显著的抗肿瘤作用。长梗秦艽，多年生草本，是龙胆科龙胆属植物，主要分布于我国西藏东部和南部地区，作为中草药曾长期用于治疗风湿性关节炎及肝胆疾病。长梗秦艽酮(waltonitone)是从长梗秦艽中分离得到的一个五环三萜化合物。有研究表明，长梗秦艽酮能够抑制肝癌细胞的增殖，同时促进肝癌细胞的凋亡[1]。与此结果类似，我们之前发现，长梗秦艽酮能抑制肺癌A549细胞的增殖并可促进其凋亡[2-3]，提示长梗秦艽酮是一种潜在的抗肿瘤药物。本研究旨在探讨长梗秦艽酮对吉西他滨耐药的肺癌H1975细胞中潜在的抑癌作用及其机制。

1　材料与方法

1.1材料与试剂人肺癌NCI-H1975细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；长梗秦艽酮(waltonitone)：上海中药标准化研究中心，用DMSO配制成100 mmol/L贮存液于-20 ℃保存；RPMI-l640培养基：美国赛默飞公司；胎牛血清：美国Hyclone公司；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒：江苏凯基生物技术股份有限公司；二甲基亚枫(DMSO)：美国Sigma公司；胰蛋白酶：美国sigma公司；Hoechst33342：美国Sigma公司；AnnexinV/PI双染细胞凋亡检测试剂盒：江苏凯基生物技术股份有限公司；流式细胞仪：美国BD公司；蛋白裂解液：美国赛默飞公司；Bcl-2抗体:CST公司；Bax抗体：CST公司；GAPDH抗体：美国santa cruz公司。

1.2细胞培养H1975细胞用含10%胎牛血清的RPMI-l640培养基在37 ℃，饱和湿度、5%二氧化碳的培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.3MTT 法检测细胞增殖消化收集对数生长期细胞，每孔加入100 μL约3×103个细胞于96 孔板中，细胞培养过夜。实验组分别加入不同浓度长梗秦艽酮溶液(10、20、30 μmol/L)作用5 d。对照组加入等量的DMSO溶液。每实验组设3 个重复孔。培养结束前每孔加20 μL MTT溶液继续培养4 h，小心吸去上清，每孔加150 μL DMSO，振荡混匀后酶标仪检测(波长570 nm)每孔光密度值(OD值)。实验重复3 次。增殖抑制率按如下公式计算：抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值×100%。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡H1975细胞以5×105/孔接种于6 孔板中培养过夜，分别加入终浓度为30 μmol/L的长梗秦艽酮溶液，并设空白对照组。继续培养24、48 h后，用不含EDTA的胰酶消化收获细胞。4 ℃、1 500 转/min 离心5 min，收集细胞，冷PBS洗涤离心细胞2 次。用500 μL 1×Binding Buffer悬浮细胞，浓度大约为1×106/mL。在细胞悬浮液中加入5 μL AnnexinV-FITC轻轻混匀，再加入5 μL PI后轻轻混匀避光孵育15 min。在1 h内用流式细胞仪检测。结果用Cellquest专业软件获取分析数据。实验重复3 次。

1.5荧光显微镜观察H1975细胞核形态将H1975细胞5×105/孔接种于6 孔板中培养过夜，每组设3 个复孔，加入30 μmol/L的长梗秦艽酮溶液继续培养24、48 h。PBS清洗2次，吹干，固定液(甲醇：冰乙酸=3∶1)固定15 min，PBS清洗后加入Hoechst 33342(浓度为5 mg/L)荧光染料1 mL，37 ℃避光孵育15 min，应用荧光显微镜观察、照相。实验重复3 次。

1.6Western Blot实验H1975细胞以5×105/孔接种于6 孔板中培养过夜，每组设3 个复孔，加入30 μmol/L的长梗秦艽酮溶液继续培养48 h。用蛋白裂解液提取细胞中的总蛋白，并用Bradford方法对蛋白进行定量。40 μg总蛋白在10%的SDS-PAGE凝胶中电泳分离并转印到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉对膜封闭2 h，然后用相应的一抗4 ℃孵育过夜(Bcl-2 1∶1 000；Bax 1∶1 000；GAPDH 1∶1 000)。对应的二抗在37 ℃条件下孵育2 h，在膜上滴加ECL发光液，通过BioImaging Systems (UVP,Upland,CA,USA)系统进行发光。

1.7统计学分析实验数据结果用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理，组间比较用单因素方差分析(ANOVA)或两组之间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1长梗秦艽酮抑制H1975细胞的体外增殖MTT实验结果显示，随着药物浓度的加大，长梗秦艽酮对H1975细胞增殖的抑制作用明显增加；而且随着作用时间的增加，长梗秦艽酮对H1975细胞增殖的抑制也增强(图1)。这些结果提示我们，长梗秦艽酮能够抑制H1975细胞的增殖，且具有剂量和时间依赖性。

图1　长梗秦艽酮对H1975细胞增殖的抑制作用

2.2长梗秦艽酮诱导H1975细胞凋亡在H1975细胞中加入30 μmol/L的长梗秦艽酮分别作用24和48 h后，通过AnnexinV/PI流式细胞仪双染法测细胞凋亡的变化。结果表明，与对照组相比，长梗秦艽酮处理能显著增加H1975细胞的凋亡，且随着作用时间的增加，早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例都有所增加，说明长梗秦艽酮能诱导肺癌H1975细胞的凋亡(图2)。

2.3长梗秦艽酮引起细胞凋亡的形态学变化H1975细胞用30 μmol/L浓度的长梗秦艽酮溶液作用后，用Hoechst 33342染料对细胞核进行染色，在荧光显微镜下观察显示，与空白对照相比，长梗秦艽酮作用于H1975细胞24、48 h后，细胞形态变化明显。随着药物浓度增大，细胞数量减少，细胞核形态变化显著，呈现核碎裂、染色质边集等细胞凋亡改变(图3)。

2.4长梗秦艽酮调节凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达H1975细胞用30 μmol/L浓度的长梗秦艽酮溶液作用48 h后，提取细胞中的总蛋白进行Western blot实验。我们筛查了与细胞增殖、凋亡相关的一系列蛋白表达的变化。结果发现，长梗秦艽酮能够抑制Bcl-2蛋白的表达，同时增加Bax蛋白的表达。如图4所示，长梗秦艽酮溶液作用后Bcl-2蛋白的表达显著下降而Bax蛋白表达显著上升，提示长梗秦艽酮对H1975细胞的凋亡诱导可能是通过对Bcl-2与Bax蛋白的调节而实现的。

图2　流式细胞术检测长梗秦艽酮诱导H1975细胞凋亡

图3　荧光显微镜观察长梗秦艽酮引起细胞凋亡的形态学变化

图4　长梗秦艽酮影响凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达

3　讨论

肺癌是严重危害人类生命健康的疾病，其发病率和死亡率在全球范围内每年仍在上升[4]。到目前为止,临床上对于肺癌的治疗仍然以手术切除为主，辅助以放疗、化疗及分子靶向治疗等方法。但是由于肺癌对放化疗及分子靶向治疗容易产生耐受和抵抗性[5-6]，在过去的十几年间，肺癌患者的生存质量和生存率并未得到很大提高。因此，发现新的治疗肺癌的药物，尤其是对放化疗及分子靶向治疗产生耐药抵抗的肺癌具有治疗作用的药物正成为研究的热点。近年来，中药抗肿瘤的研究受到了广泛的关注[7-10]，有多种具有抗肿瘤活性的中药被发现，尤其是从中药中提取的天然单体化合物。从中药中提取的天然单体化合物可以通过多种机制发挥抗肿瘤作用，其中包括抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的侵袭及转移等机制[11-14]。近年来的研究发现，天然单体化合物在减少肿瘤细胞对放化疗及分子靶向治疗耐药及抵抗性、增强药物对肿瘤细胞的敏感性等方面也发挥着重要的作用[15-22]。

本研究选取的药物长梗秦艽酮是从中药长梗秦艽中提取的五环三萜类天然化合物，具有多种生物活性。近年来的研究表明，长梗秦艽酮具有明显的抗肿瘤活性，对肝癌、肺癌等多种恶性肿瘤有明显的抑制作用[1-3]。但是，研究并不全面，尤其是对放化疗及分子靶向治疗耐药肿瘤的作用及机制尚不明确。本研究通过MTT、流式细胞仪、荧光电子显微镜、Western blot等实验方法研究长梗秦艽酮对吉西他滨耐药的人肺腺癌细胞系H1975细胞的抑制作用及其机制。MTT实验结果表明，长梗秦艽酮对H1975细胞具有增殖抑制作用，且有时间及剂量依赖性。流式细胞仪AnnexinV/PI双染法及荧光电子显微镜结果表明，长梗秦艽酮可以诱导H1975细胞凋亡，提示长梗秦艽酮抑制H1975细胞的作用可能与诱导细胞凋亡有关。进一步研究发现，长梗秦艽酮能够调节细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达，提示长梗秦艽酮可能通过Bcl-2和Bax促进肺癌H1975细胞凋亡。

综上所述，从中药中提取的天然单体化合物可以通过多靶点、多通路发挥抗肿瘤作用。本研究结果可以为长梗秦艽酮在治疗吉西他滨耐药肺癌方面提供实验依据，但仍需要进一步的动物体内实验探讨其体内抗肿瘤作用及临床应用前景。

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收稿日期：2016-04-27

基金项目：辽宁省博士启动基金项目(20121130)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201607004

Waltonitone inhibits proliferation and induces apoptosis in gemcitabine-resistent H1975 lung cancer cells

ZHANG Yia,XU Xiao-manb,ZHANG Menga,HE Pinga*

(a.Department of Geriatrics Medicine,b.Department of Respiratory Medicine,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the effects and the possible mechanisms of waltonitone on cell proliferation and apoptosis in lung cancer H1975 cells.MethodsMTT assay and Annexin V-FITC flow cytometry were used to measure the effects of waltonitone on cell proliferation and apoptosis.In addition,waltonitone-induced morphological changes were assessed by Hoechst 33342 staining under a fluorescence microscope.Finally,to explored the possible mechanisms by which waltonitone stimulated apoptosis we performed western blot to screening its potential targets.ResultsThe proliferation of H1975 cells was inhibited by waltonitone in a dose-and-time dependent manner.Flow cytometry analysis showed that waltonitone could induce H1975 cells apoptosis.Chromosome condensation and nuclear fragmentation were observed by Hoechst 33342 dying in treated H1975 cells.Waltonitone down-regulated Bcl-2 and up-regulated Bax in H1975 cells.ConclusionWaltonitone remarkably suppressed proliferation and greatly promoted apoptosis of H1975 cells possibly through regulation of Bcl-2 and Bax.

Key words：Waltonitone；Lung cancer；Proliferation；Apoptosis